《酶联免疫分析技术》PPT课件.ppt

2013-8-13,1,酶联免疫分析技术,ELISA检测,免疫检验,利用免疫检测原理检测与免疫相关的物质（抗原、抗体、补体、细胞因子等）,北京世纪坛医院李莉免疫检验技术1.酶联免疫分析技术2.放射免疫分析技术3.荧光免疫分析技术4.化学发光免疫分析技术5.金标免疫分析技术6.免疫印迹技术7.免疫电泳技术等酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA),利用免疫检测原理检测体液中的微量物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、药物浓度等）这些检测结果为临床上确定诊断，分析病情，调整治疗方案和判断预后提供有效的实验依据。酶联免疫分析技术是以酶标记抗原/抗体为主要试剂的一种标记免疫分析技术，利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原抗体免疫学反应检测的敏感性.历史,1971 年 瑞 典 学 者 Engvail 和 Perlmann,荷 兰 学者 Van Weerman 和 Schuurs 分 别 报 道 将 免 疫 技术 发 展 为 检 测 体 液 中 微 量 物 质 的固 相 免 疫 测定 方 法，即 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。,Ab Ag和Ab 分离，然后测定Ab Ag或Ab 的量，,2013-8-13,酶联免疫吸附实验的原理,以待测 抗原（或 抗体）与酶 标抗 体（或 抗原）的特异 结合 反应为 基础，通 过酶 活力测 定来 确定抗原（或抗体）含量。因为 结合 了 免疫 反 应 和 酶催 化 反 应，所以 是一种特异而又敏感的技术。,酶免疫技术,Ab*+Ag,Ab*Ag+Ab*,异相法：*从而推算出 Ag量。,Ag,*,过量Ab,*,AbAg,*,Ab,均相法：Ab*Ag中的标记物*失去特性，直接测定游离Ab*的量，从而推算出Ag量。,Ag,*,过量Ab,*,AbAg,*,Ab,1,特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。2,2,最适比例,2013-8-13,3 敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达 ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达 0.1ng/ml。,特点,灵敏度高特异性强准确性好试剂稳定方法简便,酶联免疫吸附实验方法类型：,酶联免疫吸附实验的分类双抗体夹心法（三明志法）原理,固相支持物表面3,包被抗体,标记抗体,待测物,底物,一步法 ELISA 反应会出现钩状效应,1.双抗体夹心法（主要用于测抗原）2.间接法（主要用于测抗体）3.竞争法（主要用于测小分子抗原/半抗原和抗体）4.捕获法（主要用于测血清中某抗体的亚型）钩状效应（hook effect）一般情况下的双抗体夹心法ELISA反应抗原过量时,2013-8-13,间接法原理,间接法的影响因素正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影,包被物底物待测物底物,标记抗体待测抗体标记抗原包被抗体,固相支持物表面竞争法测抗原的原理,（7）酶反应终止 液。固相支持物表面,响抗原的纯度对间接法测抗体的影响ELISA试剂盒组分：ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；,结合物即酶标记的抗体（或抗原）是 ELISA中关键的试剂1 酶的催化活性2抗体（或抗原）的免疫活性3含有或少含有游离的抗体（或抗原）,4结合物尚要有良好的稳定性。4,酶标记的抗原或抗体酶标抗原 天然抗原 重组抗原 合成多肽抗原酶标抗体 单抗 多抗,2013-8-13,酶及底物,HRP的底物,DH2+H2O2,D+2H2O,上式中，DH 2为供氧体，H2O 2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。OPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在 492nm 处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是 HRP 结合物最常用的底物。,E,TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与 H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于 H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。洗涤液,常用的 HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色常用的稀释液为含 0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。液的最终体积而异，在板式 ELISA中一般采用 2mol/L。5,AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对 硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm波长处有吸收峰。用 NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸 4-甲基伞酮），可用于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。酶反应终止液,2013-8-13,对照设定阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negativecontrol)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如 HBsAg检测,参考标准品定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的 4-5 个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.,酶免疫测定操作中的注意事项,的阴性对照品中不可含 HBsAg，最好抗 HBs也是阴性。酶免疫测定操作中的注意事项,试剂准备,加样温育洗板显色比色结果判断结果报告及解释,标本的采取和保存 标本为血浆和血清均可，血清标本应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色，出现假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。5天内测定的血清标本可放置于 4，超过一周测定的需低温冰存。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如,需保存作多次检测，宜少量分装冰存。6,试剂的准备从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒 中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。同时应将相应的质控取出待温度达到与室温平衡。注意：检验人员应经常核对试剂说明书的具体内容，能够及时发现实验操作程序的更改和标准曲线指控定值的更新。所用蒸馏水或去离子水应保证质量。,2013-8-13,7,保温ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本和酶标记抗体，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因 此 需经 扩散 才能 达 到反 应的 终点。这 就 是为 什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育,温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所,需时间相对较短。,“边缘效应”的排除:使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。,保温温 育 常 采 用 的 温 度 有 43、37、室 温 和 4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。保温的方式一般均采用水浴，可将 ELISA 板置于水 浴 箱中，ELISA 板 底 应贴 着水 面，使温 度 迅速 平衡。为避免蒸发，板上应加盖。另外保温的方式还有ELISA仪器附有特制的电热块反 应 板 均 不 宜 叠 放，以 保 证 各板 的 温度 都 能 迅速平衡。室 温 温 育 的 反 应，操 作 时 的 室温 应 严格 限 制 在规 定 的 范围 内，标准 室 温温 度 是指 20-25，应注 意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。加样ELISA中一般有 3次加样步聚：即加标本，加酶结合物，加底物。,加样时应将所加物加在 ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注,意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更,换 吸 头，以 免 发 生 交 叉 污 染。然 后 在 微 型 震 荡 器 上 震 荡 1分 钟 以 保 证充分混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴,加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。,洗涤,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,洗涤的方式：自动洗涤仪,手工操作,全自动加样系统的标本“交叉污染”问题洗板,每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系。洗板液一般为含 0.05%Tween20的中性PBS。Tween20 为 一 种 非 离 子 去 垢 剂，既 含 亲 水 基 团，也 含 疏水基团。洗涤作用机理，借助其疏水基团与固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相,洗 板 液 中 Tween20 浓 度 高 于 0.2%，可 使 包 被 于 固 相 上 的抗原或抗体解吸附而影响试验测定下限。,2013-8-13,8,显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。注意：OPD底物显色一般在37反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应.OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。显 色,加入底物 A和B后，应振荡混匀,当底物为 OPD时，显色反应应避光进行一般商品试剂盒显色反应条件为 37 或室温反应 1530 min。从理论上说，37 30分钟才可以使 HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的 10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在 37下反应2530分钟后，终止反应比色测定。,显色TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作 台 上，边 反应 观 察 结果。但 为保 证 实 验 结 果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB 经 HRP 作 用 后，约 40 分 钟 显 色达 顶 峰，随即逐渐减弱，至 2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止能使蓝色维持较长时间。此 外，各 类酸 性 终 止液 则 会 使蓝色 转 变 成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。比色,加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀,先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中，正确选择波长和参比波长。用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动 ELISA 板的位置。例如 OPD 用 492nm 为 W1，630nm 为 W2，最终测得的 A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到 0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。操作时室温宜在 15-30，使用前先预热仪器 15-30 分钟，测读结果更稳定。,结果判断在间接法和夹心法ELSIA 中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。,结果判定1、定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的简单回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。“阳性”表示该标本在该测定系统中有反应。“阴性”则为无反应。用定性判断法也可得到 半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。根据实验条件的不同、阴性对照值和阳性对照值来判定阴阳。2、定量测定的结果判定是每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线，根据标本的吸光度值不同来确定待测物的浓度。,9,2013-8-13质量控制（Quaility Control,Q.C）,结果判断：按试剂盒所定的 CUT-OFF 值判断阴或阳性结果，不能以其它标准判断。Cut-off 值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现，即敏感性和特异性相加的值达到最大。结果报告：阴性或阳性。灰区内的结果建议患者过一段时间复查。室内质量控制质控品浓度的选择S/CO 2-3或同时选择 S/CO处于1.5左右的质控血清以判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。CUTOFF 值计算S/CO 值计算绘制质控图质控图-定性,质控血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的 检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。质控图-定量失控的处理及纠正,2013-8-13,10,ELISA法检测失控纠正措施,+2-2s,+1-3s分析失控原因（质控品、试剂、检测环节）复检所有阳性样本-2-2s,-1-3s,分析失控原因（质控品、试剂、检测环节）复检所有阴性样本,标本因素试剂因素操作因素,ELISA测定影响因素,标本因素,内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融,内源性干扰因素,1.类 风 湿 因 子：人 血清 中 IgM、IgA 型类 风湿 因 子（rheu-matoid factor,RF）可以与 ELISA 系统中的 捕获抗体及 酶标志二抗 体的 Fc 段直接结合，从而 导致假阳性。2.补 体：ELISA 系统中一抗和标记二抗过程 中，抗体 分子发生变构，其 Fc 段的CIq分子结合点被暴露出来，使Ciq 可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：（1）用 1.5 乙二胺四 乙酸二钾盐（EDTA）稀释标本；（2）用530C10min 加热血清使 Ciq灭活。3.嗜 异性 抗体：人类血清中含天然嗜异性抗体，该 抗体将 ELISA 系统中一抗和标记二抗二者连接起来，也可导致假阳性。4.嗜靶抗原的自身抗体：抗甲状腺球旦白、抗胰导素抗体等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成抗原-抗体复合物，在ELISA 测定方法中均可干扰抗原-抗体测定结果。,内源性干扰因素5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体：临床开展的用医源性CD3等单克隆抗体，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等技术，均可使这些患者产生抗体这些患者在ELISA测定时均可产生假阳性。6.病毒变异：病毒变异所致的假阴性主要表现在HB-sAg的检测，HBV的S基因负责编码表达表面抗原，即S旦白，任何影响S旦白表达水平或抗原性的突变，都可能导致表面抗原检测出阴性结果。7.标本中其它成分的影响：血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液黏度过大等，均对ELISA结果有干扰作用。,外源性干扰因素1.标本溶血：由于各种人为因素引起的标本溶血，均可因红细胞破坏时释放大量过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化酶为标记的ELISA测定方法中，会导致非特异性显色，而干扰测定结果。2.标本受细菌污染：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色，而干扰测定结果。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在 2 8下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在 70以下3.标本保存不当：在冰箱中保存过久的标本，血清IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性；标本放置时间过长，有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA标本宜为新鲜采集，如不能测定，5天内测定的可放40C冰箱，1周后测定的应放低温保存，冻存后溶解的标本，蛋白局部浓缩，分布不均，应充分混均后再测定，但混均时应轻柔，不可剧烈振荡。,2013-8-13,11,外源性干扰因素,4.血液采集后，如收集管中无促凝剂和抗凝剂，则血液通常在半小时后开始凝固，1824h 完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留 部 分 纤 维 蛋 白 原，如 将 其 加 入 微 孔 中，在 ELISA 测 定 过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。5.标本管中添加物质的影响：抗凝剂（如肝素 EDTA）、酶抑制剂（如 NaN3 可可抑制辣根过氧化酶活 性）及快速离心胶等均可对测定产生一定的干扰作用。,影响ELISA试剂盒质量的因素,固相材料:聚苯乙烯塑料抗原:纯化、合成和基因工程抗原抗体：多抗、单抗和基因工程抗体酶结合物：酶免疫测定的核心成份色原底物：OPD和 TMB运输贮存,影响ELISA测定的因素,实验操作,酶联免疫吸附实验操作要点,优质的试剂良好的仪器熟练的操作人员严格实验环境标本的状态严格遵照规定操作,ELISA常出现的问题1.弱阳性质控品检测不出？温育的时间、湿度不够 显色反应的时间不够 所配制缓冲液有问题 加样枪是否准确和校正 质控品是否合格 试剂的灵敏度是否达标 操作人员是否存在操作问题,ELISA常出现的问题2.测定的重复性差？加样本和试剂的量不准，加样过快，孔间发生污染。加错标本或标本加在孔壁上部非包被区。不同批号试剂组合混用。反应时间不同，温育不均衡。孔内有污染。板的包被不均匀。标本未 完全 凝固，加入 易出现 纤维 蛋白 凝块或 残留的血细胞，易出现加阳性。洗板机堵塞。,酶标仪滤光片及光源不足等。,2013-8-13,12,ELISA常出现的问题,3.白板（阳性对照不显色）漏加酶结合物，,洗液出 现问 题（含 有酶 抑制物 或错 把终 止液当 浓缩洗液），加 显 色 液 时 只 加 A 液/B 液，把 终 止 液 当 成 显 色液，使用加终止液的容器加显色液。4.全部板均显色或间隔有规律的显色？,洗板机管路不通。显色液变质（配制时间过长），底物受酶污染，洗液受酶污染，错用了抗原/抗体的酶容器。,测定前的质量控制,实验室设施、仪器设备及管理,理想的试剂和操作方法 人员培训,环境监控记录,检测中外部影响因素温度湿度通风噪音仪器设备的正确使用,加样器全自动加样系统的“拖带现象”,酶标仪：单波长、双波长比色？洗板机,仪器设备的校准周期人员培训,免疫测定通常为手工操作，要得到可靠的测定结果，操作人员需要一定技术知识和经验。在实际工作中，,不同的操作者所获得的结果往往变化较大，因此，人员的培训非常重要。知其然知其所以然。,质控品1.浓度选择2.保存原则3.使用效期,试剂1.保存原则2.开瓶有效期3.批间差评价,2013-8-13监测质量保证,仪器标准化操作程序,作业指导书13,