《酶组织化学》PPT课件.ppt

酶组织化学,掌握内容,酶组织化学的基本原理光镜酶组织化学的基本方法几种重要的酶组织化学方法,概 述,酶的组织化学 利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法 特点：在原位检测 检测酶的活性而不是酶分子本身,酶组织化学发展历史,1939年以前：主要研究细胞内的氧化还原反应，未出现酶组织化学方法（如Klebs和Stuve 指出愈创木酯酊同脓作用能产生蓝色过氧化物酶）1939年：酶组织化学真正开始 高松英雄和Gomori碱性磷酸酶（硫化钴反应、银反应）同年，酸性磷酸酶组织化学方法也发表,酶组织化学发展历史,1940-1950年：酶组织化学发展的黄金时期 创立了金属盐法、偶联偶氮色素法50年代后：电镜酶组织化学 将超薄切片法和电镜技术应用到酶组织化学上，获得了酶的更精确的定位60年代后期：免疫组织化学 利用抗原抗体特异性反应来定位酶蛋白 电镜免疫组化,酶的种类,1.氧化还原酶 2.转移酶 3.水解酶 4.裂合酶（裂解酶）5.异构酶 6.合成酶（连接酶）目前，能用酶组织化学方法显示出来，并可进行定性、定位和定量的酶较少，仅200余种，因此潜力巨大。,（一）酶的特性,水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂有机溶剂不同程度降低酶的活性易受温度影响，对热耐受性弱对干燥耐受性强,酶组织化学反应的基本知识,（二）酶的定位,酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位 如：5-核苷酸酶浆膜 ATPase肌球蛋白 细胞膜 线粒体,（三）酶组化的基本条件,同时保存结构和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的扩散或移位 保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：温度 PH值 抑制剂 激活剂,基本原理 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物），然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物，该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在,（四）原理及一般原则,第一反应：酶促反应 底物 初级反应产物（PRP）不可见 第二反应：捕捉反应 PRP+捕捉剂 终反应产物（FRP）,酶,*PRP弥散：1.底物在酶催化下反应的速度 2.PRP在缓冲液中的弥散系数 3.PRP与辅助物反应的速度 应选择合适的底物和辅助物,减少弥散,一般原则,对组织处理,制片过程不能影响酶活性及分布所选底物和辅助物必须迅速、同步穿透入组织和细胞中所选底物最好只能被一种酶催化分解(一个底物可能同时发生几种酶反应，为获得特异酶反应，必须使用酶抑制剂或酶激活剂进行鉴别。),一般原则,4.所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反应试剂的穿透性5.PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色稳定产物6.所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合,(五)酶组织化学的主要步骤,1、固定或不固定的标本2、切片(冷冻或不冷冻)3、孵育4、显色5、显微镜下观察,（六）各步骤注意问题,检测方法的选择酶的保存与固定 一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片(-70长期保存；可用丙酮氯仿=114，510分钟稍固定)固定剂:抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂；慎用醛类固定方法:浸泡固定 灌流固定固定温度:04,3.切片制作:切片厚度40um，一般812um4.缓冲液选择 缓冲液用于 A.配置固定液 B.漂洗液 C.配置酶反应孵育液 选择缓冲液应注意 A.不能减弱目标酶的活性 B.不能含有与捕捉机制相同的物质 C.注意漂洗用缓冲液的渗透压 D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同,5.孵育反应 A.孵育液配置:底物浓度量要足够120(V/V);孵育液只能用一次，配制时要适量,配制孵育液的要求 清洗器具，过酸冲洗。现用现配，保持新鲜。严格配比，保持平衡。防止污染，过滤为佳。优选试剂，注意纯度。,5.孵育反应 B.孵育的温度和时间:37 15-30min C.切片孵育法-切片孵育-漂浮孵育,6.酶特异性对照实验 用酶活性抑制剂 采用无底物的孵育液 过固定或加热 用针对目标酶的激活剂 改变孵育液底物 选择PH 酶细胞内的定位差异,对结果的分析应考虑的问题,1、经过冻结和固定后，酶究竟能保存多少？2、酶是否在原位？3、反应中酶起了多少作用？4、酶的活性是否代表了细胞生活时的状态？5、沉淀的产物是否能代表酶本身，时间延长，会不会改变？有没有扩散移位？,显示酶的组织化学方法,一、金属离子沉淀法（金属金属盐法）金、银、铜、铁、铝、钴等金属 利用某些金属本身具有颜色或其化合物具有颜色（硫化钴，黑色；硫化铅，棕黑色等）原理：以酶作用于底物时，分解产物与底物混合液中的某种物质结合，沉着在作用的局部，接着用金属置换结合物质，通过金属显色来证明酶的反应。,优点：反应迅速，沉着颗粒微细，色调美丽，且由于金属离子的高电子密度而可用于电镜组织化学研究。缺点：金属盐的移动、扩散和吸附现象 一般用于显示磷酸酶。如：AKP，ACP，G-6-Pase、ATPase、TPPase、ACase,碱性磷酸酶（AKP）,碱性条件下（）催化各种醇和酚的磷酸酯水解激活剂：Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+抑制剂：半胱氨酸、氰化物、砷酸盐定位：转运功能活跃的细胞膜，广泛存在于肾小管、小肠绒毛、膀胱、肾上腺、肝、脾、乳腺及卵巢。,碱性磷酸酶（AKP）钙钴法,原理以天然存在的甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。,碱性磷酸酶（硫化钴法或钙钴法）,若将磷酸钙浸渍于硝酸银溶液，则置换成磷酸银然后用其还原剂使其产生银反应，称为硝酸银法或银反应法,1、上述方法有两个阶段：酶作用产物沉着阶段，金属置换的第二阶段，称为二步显示法（孵育后偶联法）优点：是可以充分满足这两种反应的最适PH；有时酶促底物的水解反应要求较长的孵育时间，而有些各自要求的辅助物在这段时间中已开始分解，用二步显示法可避免此不足。局限性：是要求PRP停留原位不发生弥散。,方法标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片，厚8微米。固定：丙酮氯仿（11）混合液。4 25切片标本入下列孵育液中，37，时间摸索 孵育液：3甘油磷酸钠 底物 2巴比妥钠 调PH 2氯化钙（无水，或硝酸钙）沉淀剂 2硫酸镁 激活剂 蒸馏水 将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4,流水流水洗2分钟后入蒸馏水 入2硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟）流水洗5分钟，入蒸馏水。入0.5硫化胺，2分钟。流水洗10分钟，入蒸馏水。入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟 流水洗5分钟蒸馏水。甘油明胶或Apathy糖胶封固,结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛纹状缘和血管内皮出现棕黑色或黑色的硫化钴沉淀，显示AKP活性强。评价：此法反应产物可发生扩散，定位欠准确；,肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法 X100,肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法 X200,大鼠小肠绒毛吸收细胞呈深棕色,对照 无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3甘油磷酸钠，其余各步进行同上。加热灭活酶活性。加抑制剂，左旋咪唑0.11.0mmol/L,注意事项Ca2+要足量 用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性 有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色 素）出现，可影响结果。也可用石蜡切片，（石蜡切片可显示大多数水解酶）本法可用显示：5核苷酸酶、肌蛋白ATPase、AKP,金属离子沉淀法,2、同步法细胞中的酶催化底物水解生成的分解产物立即与金属离子反应成为有色不溶的沉积在原位以显示酶的存在。如：酸性磷酸酶铅法,铅法显示酸性磷酸酶(ACP),原理 以甘油磷酸钠为底物，在酸性PH下，被ACP水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成磷酸铅沉淀。在被S2-置换，最终生成硫化铅棕色沉淀。,酸性磷酸酶硝酸铅法,要求：在底物溶液中的H浓度为弱酸性的条件常用硝酸铅或醋酸铅应用：酸性磷酸酶和在中性附近其作用的磷酸酯酶类。最早把本法应用于酸性磷酸酶的是Gomori（1941），也称为硫化铅法该方法金属离子容易反应，沉着颗粒微细，反应色调美丽，反差比较鲜明。,ACP的特性 PH 4.55.5适宜 激活剂：Mn2+抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石 酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。ACP定位 溶酶体（颗粒状）内；溶酶体外ACP存在于ER和胞液。该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、肾上腺。,方法：标本：大白鼠肾、肝恒冷箱切片，6-8微米固定：本实验不固定或固定于丙酮氯仿（11）25min或10福尔马林钙10min步骤：入孵育液中 37 孵育液：0.1M醋酸缓冲液，PH4.75.0 0.24硝酸铅 3甘油磷酸钠 要求完全透明后，过滤备用（可用Tris顺丁烯二酸缓冲液或乙酸巴比妥缓冲液）,于37蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温蒸馏水洗）入5硫化胺，12分钟。流水冲洗35分钟后，换蒸馏水。（可用苏木精复染核）用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。,结果 酶活性部位棕黑色硫化铅沉淀。分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒 对照：1、孵育液内加0.01M NaF 2、去底物实验,肾小管上皮细胞,注意事项 铅离子的浓度是关键问题，没有底物，有些组织吸附铅离子（+），因此必须用NaF抑制酶活性排除假阳性反应。孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。,应用范围“铅法”适用于：ACP，5-核苷酸酶、G6P酶;膜ATPase、MitoATPase、TTPase（硫胺素焦磷酸酶）,显示酶的组织化学方法,二、偶联偶氮色素法（偶氮色素法）指用人工合成的酶底物，在酶的作用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的定位。,（二）偶氮偶联法（偶氮色素法）1.原理底物混合液 PRP与 不溶性 重氮盐结合 偶氮色素2.方法 同时偶联法 后偶联法,酶,偶氮偶联,显示酶的组织化学方法,重氮盐种类不同，其偶氮颜色多样（蓝色、紫色、红色、褐色、黑色、棕色等）重氮盐还有不同程度的抑制酶活性作用，故必须选用其中抑制作用最弱的种类使用。,常用底物 萘酚AS-BI 萘酚AS-D 萘酚AS-MX 萘酚AS-TR常用重氮盐 坚牢兰RR 坚牢兰B 坚牢红RC 坚牢红TR 坚牢紫B 六偶氮副品红 六偶氮新品红应用：可显示ALPase,ACPase,酯酶,转肽酶,肽酶,-葡糖苷酶等,偶氮色素法分类,（一）同时偶联法在底物混合液中，通过酶的分解作用所得到的沉积物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。（二）后偶联法为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素。,偶氮偶联法显示ACP原理 以奈酚的衍生物磷酸酯为底物，在酸性PH（5.2）下，经酸性磷酸酶水解释放出萘酚ASBI，立即与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。,方法标本：大白鼠肾、肝恒冷箱切片，厚8-10微米。不固定或固定于丙酮氯仿（11）混合液内，4，25min 标本入下列孵育液，37，3060分钟。孵育液：磷酸奈酚ASBI 二甲基亚砜（溶剂）六氮化对品红 缓冲液 充分混匀并过滤,蒸馏水洗 入Mayer苏木精内染1分钟。流水冲5分钟后入蒸馏水。用Apathy糖胶或甘油明胶封固。结果 酶的活性部位呈红色，核兰色。分布于肾近端小管核周，肝毛细胆管周围。,涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶 X400,对照用抑制剂NaF浓度为10mmol/L注意事项 六氮盐浓度不能太高 背景会略带黄色,显示酶的组织化学方法,三、色素形成法 在酶作用下使无色化学物质在局部形成色素沉着1、四唑盐法2、联苯胺色素法3、靛酚蓝法（吲哚酚法）,显示酶的组织化学方法,（一）四唑盐法 含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液，在脱氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原子与无色的四唑盐或双四唑盐相结合，形成红色或蓝色的甲臢或二甲臢色素。,四唑盐法,用于显示氧化酶和脱氢酶原理:四唑盐或双四唑盐 氢离子 与 与 底物混合液 无色四唑盐结合 红色或兰色的沉淀,脱氢酶,+2H,被还原,常用四唑盐种类 三苯四唑氯化物 TTC 蓝四唑盐 BT 新四唑盐 NT 硝基蓝四唑 NBT 四硝基蓝四唑 TNBT 噻唑蓝 MTT,以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（NBT）为受H体，其接受H后被还原成紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性。,四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富 抑制物：丙二酸盐（竞争抑制）对照,【孵育液】0.1M 琥珀酸钠,0.1M 磷酸盐缓冲液 NBT(硝基蓝四唑)【步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片 2.孵育液15-35 分钟 3.生理盐水洗 4.Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟 5.入80%乙醇5分钟 6.甘油明胶封固【结果】酶活性处为蓝紫色沉淀,小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶 X400,思考题：在细胞培养中，常用的MTT法测定细胞活性，用的是什么原理？检测的是什么酶？,显示酶的组织化学方法,（二）联苯胺色素法检测过氧化物酶酶作用释放的氧使无色的联苯胺脱氢而形成有色的联苯胺蓝，再形成联苯胺褐。【结果】酶活性处呈棕色,过氧化物酶 催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化 见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等 髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要 免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大分子示踪剂,【显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶【基本原理】过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺，DAB），催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀【作用液】DAB，Tris-Hcl缓冲液，H2O2【结果】酶活性处呈棕色,小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶*400,白血病涂片-过氧化物酶 X400,显示酶的组织化学方法,（三）靛酚蓝法（吲哚酚法）用于检测氧化酶，也可用于细胞色素氧化酶和过氧化物酶等。把二甲基对苯二胺和萘酚加入底物混合液中，由酶作用而释放的氧与此二者发生结合，形成靛酚蓝，而显示出酶的定位。,如细胞色素氧化酶,显示酶的组织化学的其他方法,色素底物法是将有的色素盐类作为酶的底物，它本身不染组织细胞，但在酶的作用下分解出来的色素却能沉着于酶所在部位。底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在部位，通过各种方法对此进行检测。,酶组织化学的应用,了解组织、细胞的代谢活动细胞类型的判断了解细胞定位用于肿瘤的研究用于免疫组化和杂交组化的显示手段,要求掌握的酶,碱性磷酸酶酸性磷酸酶葡萄糖6磷酸酶三磷酸腺苷酶乳酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶过氧化物酶法,