《酶的非水相催化》PPT课件.ppt

Chapter 10 Enzymatic catalysis in Non-aqueous system,酶的非水相催化,水是酶促反应最常用的反应介质。,但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。,由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。,是否存在非水介质能保证酶催化？,1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。,1984年，克立巴诺夫等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功的利用酶在有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应；也可以在水和有机溶剂组成的双液相体系中进行催化反应；还可以在只含有微量水的有机溶剂，又称微水介质中进行催化反应。这些结果表明，只要条件适合，酶可以在有机介质催化疏水性底物进行反应转化为产物。使酶在非水介质中的催化作用研究取得了突破性的进展。,人们对有机介质中酶的催化作用进行了许多研究表明酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶，过氧化氢酶、过氧化物酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶等氧化还原酶以及醛缩酶等转移酶中的十几种酶都可以在适当的有机溶剂中起催化作用。而且酶在有机介质中的热稳定比在水溶液中显著提高。,近20年来，酶在非水相介质，特别是有机介质中的催化反应受到重视，发展很快。在理论上进行了非水相介质中酶的结构和功非水介质中酶的作用机制，非水相介质中酶催化作用动力学等方面的研究，初步建立起非水酶学的理论体系。并进行了非水介质中，特别是在有机介质中酶催化作用的运用研究，利用酶在有机介质中的催化作用进行多肽、酯类等的生产，在淄体转化，功能高分子的合成，手性药物的拆分等方面均取得显著成果。,Contents of chapter 10,10.1 非水介质酶学基础,10.1.1 非水介质体系与非水相生物酶学特点,10.1.2 非水介质中酶的结构与性质,10.1.3 水在酶催化反应中的作用,10.1.4 有机溶剂对酶催化反应的影响,10.1.5 有机溶剂对酶促反应动力的的影响,10.2 非水介质中酶催化反应与应用,10.1 非水介质酶基础,10.1.1 非水介质体系与非水相生物酶学的特点,有机溶剂系统(organic solvents)超临界流体体系(supercritical fluids)气相体系(gases)低共熔混合体系(eutectic mixtures),生物催化反应的非水介质体系：,（1）水不互溶有机溶剂单向体系,有机溶剂单向体系是指用水不互溶的有机溶剂取代几乎所有的水，即有机溶剂含量98%，有机溶剂中含有微量水2%，固相酶分散在单项的有机溶剂中形成颗粒。虽然宏观地看在此体系中酶是干的状态，但是其表面必须有能保证酶的催化活性的残余的结合水。,（2）水互溶有机溶剂单相体系,水互溶有机溶剂单相体系是指由水和与水互溶的有机溶剂组成的反应体系，酶、底物、产物均匀溶解于该体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。有些酶在水-有机溶剂单相体系中反应选择性会增加。,（3）水-有机溶剂两相体系,水-有机溶剂两相体系是指由水相和非极性有机溶剂相组成的宏观上分相的反应体系。底物和产物溶解于有机相中，酶溶解于水相中，有机相一般为非极性的、亲脂性的溶剂。在空间上酶与有机溶剂的分离可保证酶不直接与有机溶剂接触而处于事宜的水相环境中，水相中有限的有机溶剂会大大降低对酶的抑制作用，同时，反应中产物及时转移将促进反应有利于产物生成的方向进行。,（4）反相胶束体系,反相胶束体系是指表面活性剂与少量水存在的有机溶剂体系。表面活性剂分子式有疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水的有机溶剂中，它们疏水性基团与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成一个反相胶束，水分子聚集在反相胶束内核中形成小水池，里面容纳了酶分子。,反胶束体系：是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。,反胶束体系的制备,（5）超临界流体体系,除了亲脂性有机溶剂外，超临界气体，如二氧化碳、氟利昂湖泊无机化合物等都可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂，酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳定。超临界气体对多数酶都能适用，酶催化的酯化、转脂、醇解、水解、羟化等反应都可在此体系中进行。,（6）低共熔混合体系,低共熔酶促反应是继有机相没促反应基础上发展起来的新的酶促反应技术。低共熔状态是由两种或多种固体化合物混合而得到的具有一个最低共熔点的状态，在低共熔固-固体系中进行的酶促反应的特点是靠反应底物形成低共熔点，由于反应体系的液-固体积比远小于水溶液或有机溶剂，从而反应底物浓度高、反应速度快、产物浓度和收率高。反应体积小，还可以大大降低产物分离提纯的成本。,非水相生物酶促反应的特点,1.可以将加水分解反应转为其逆反应2.热稳定性比水中要高3.改变酶对底物的转移性4.从低沸点的溶剂中可以容易地分离纯化产物5.能抑制依赖于水的某些不利反应6.没有微生物的污染7.固定化酶方法简单，在非水系统中酶不易脱离吸附的表面,10.1.2 非水介质中酶的结构和性质,1非水介质中酶的结构,采用X线衍射技术比较枯草杆菌蛋白酶结晶结构发现三维结构变化很小、活性保持完整，用固态N磁共振（solid-NMR）对溶菌酶活性部位组氨酸N标记在丙酮和水中化学位移研究结果相同，用电子顺磁共振（EPR）技术证明在有机溶剂中乙醇脱氢酶保持天然的构象。另外，应用傅立叶变换红外光谱（FT-IR）和环境扫描电镜（ESEM）等其他手段对在有机溶剂和水溶液中酶蛋白的结构和酶活性进行比较研究后也都发现：在不同介质中酶分子活性中心的改变不大，而酶分子结构的动态变化可能是引起酶活性变化的主要原因。,刚-柔并存刚性：生物大分子结构的精确性柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。,苯乙酸复合物模型中活性位点示意图,图 1.5 苯乙酸复合物模型中活性位点示意图Scheme 1.5 Environment of the active site in the phenylacetic acid complex.（Jing,H.J.Mol.Catal.B-Enzym.,2000,(11):45-53.）The phenylacetic acid ligand is shown as a ball and stick representation,with the important residues in the binding site highlighted as liquorice.The mesh represents a solvent-accessibility surface for the protein calculated using a 1-radius probe.,PGSO结合活性位点的电子云密度图,图 1.6 PGSO结合活性位点的电子云密度图Scheme 1.6 Stereoview of the electron density map of PGSO bound in the active site of WT-PGSO.（Ren,L.G.J.Mol.Catal.B-Enzym.,2002,(18):3-11）,酶在水溶液中以一定的构象的三级结构状态存在，这种结构与构象是酶发挥催化功能所必须的“紧密”（compact），又有“柔性”（flexibility）的状态。紧密状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，而溶液中水分子与蛋白质的功能集团之间所形成的氢键使蛋白质分子内氢键受到一定的破坏后，蛋白质结构变得松散而呈一种“开启”（unlocking）状态。Zacs认为酶在疏水（1%）的有机溶剂，与蛋白质分子形成分子间氢键的水分子极少，此时蛋白质分子内氢键起主要作用，蛋白质变得“刚硬”（rigidity），活动的自由度的变小，限制了疏水环境下的蛋白质构象像热力学稳定状态转化，能够维持着和水溶液中同样的结构与构象，不变形而且还能表现出催化活性。,2非水介质中酶的性质,由于受到非水介质的影响，改变底物存在的状态及酶与底物相结合的自由能，这些都会影响到非水介质中酶某些主要的性质，如热稳定性、底物特性、立体选择性、区域选择性和化学键选择性等。,（1）热力学稳定性,酶的热不稳定性分为两种情况：一种是当酶处于高温中随着时间延长逐步发生的不可逆的失去活性；另一种是由热诱导产生的酶分子整体伸展失活，这种通常是瞬时的、可逆的失活。在这两种情况下，水通过对Asn/Gln残基脱氨和肽键的水解对蛋白质分子的构象变化运动起关键作用。,在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。,某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性,本章目录,酶活性丧失的可能原因：,（1）有机溶剂直接作用于酶（2）有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。,单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响,低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化,例：有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水浓度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化,反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加,超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。,超活性产生机理,（2）酶的特异性,当一种溶剂转入另一种溶剂时，酶的特异性发生了改变。酶的这些特异性包括底物特异性、对映体选择性、潜手性选择性、位置选择性和化学键选择性。,底物选择性,底物选择性（substrate selectivity）是指酶具有区分两个结构相似的不同底物的能力。它取决于底物疏水性能的差异。在有机相中有机溶剂取代了水后情况就大不相同，因为底物与酶之间的疏水作用不重要了。溶剂的改变会引起底物在水与有机溶剂两相分配系数的改变，从而导致在有机溶剂中底物专一性的改变。,例：醇脱氢酶催化烷醇氧化为醛，在水溶液中辛烷是最佳底物，再反向微团包裹后则丁醇更快被氧化。,有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。,立体选择性,从有机合成的角度看最有价值的酶的特异性是立体选择特异性（stereoselectivity），尤其是对映体特异性（enantioselectivity）和潜手性选择性（prochiral selecftivity）。有机溶剂能够改变酶的对映体特异性和潜手性特异性。,位置选择性和化学键选择性,有机相中酶的位置特异性也能够通过溶剂来进行控制。酶可以选择性地催化底物中某个区域的基团反应，称为位置特异性（regioselectivity）。化学键特异性（chemoselectivity）是指酶选择性地催化底物分子中不同功能基团中某个基团反应，与传统的化学催化所不同的是这个选择性可以在没有基团保护下进行催化反应。,（3）其他特性,1）分子记忆2）pH记忆和离子强度,有机相生物印迹酶,枯草杆菌蛋白酶溶液含N-Ac-Tyr-NH2,冻干,除去抑制剂,枯草杆菌蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶溶液不含N-Ac-Tyr-NH2,冻干,枯草杆菌蛋白酶,（1）,（2）,在辛烷中催化酯化反应的速度比较：,反应（1）中得到的酶比反应（2）中得到的酶高100倍,在水溶液中其活性：,相同,有机相生物印迹酶,酶在含有其配体的缓冲液中，肽链与配体之间的氢键等相互作用使酶的构象改变，这种新构象除去配体后在无水有机溶剂中仍可保持，并且酶通过氢键能特异地结合该配体，这种方法叫生物印迹。利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的新酶称为生物印迹酶。,有机相生物印迹酶,酶的水解活力与溶解酶的缓冲液pH值有很大关系,酶具有“记忆”pH值的能力,pH记忆：有机溶剂中的酶能够保持它冷冻干燥前或沉淀前所在缓冲液中的pH时的状态应用：控制有机相中酶催化的最适pH,10.1.3 反应体系中水对酶催化反应的影响,一必需水二酶的选择三溶剂及反应体系的选择四pH选择和离子强度的影响,反应体系中水对酶催化反应的影响,酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水含量。,必需水,概念：紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。,干燥的酶水合过程：,（1）与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）（2）与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)（3）凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.250.38g/g）（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。,影响酶反应体系中必需水含量的因素,a不同酶需水量不同b.同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同；溶剂疏水性越强，需水量越少,胰脂肪酶活性与含水量的关系,表征必需水作用的参数-热力学水活度,即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与相同条件下纯水的蒸气压之比。该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。,在有机反应体系中控制水活度的方法,将底物溶液和酶分别与一种无机盐的饱和溶液与平衡向干燥的反应物中直接加入水和盐，在一定温度压力下建立平衡向经过脱水的干燥溶剂中添加定量的水利用水活度仪,10.1.4 有机溶剂对酶催化反应的影响,常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别。极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。,1.有机溶剂对酶必需水的影响,有机溶剂可以通过作用于酶分子水合的水分子而 直接影响酶的结构与功能。,极性弱的溶剂对酶的必需水影响较少，强极性溶剂能够溶解大量的水，从而从酶表面夺取维持酶催化结构与功能所必需的水。,疏水性溶剂不易吸收酶的必需水，因此破坏酶的结构和活性的可能性较少。,有机溶剂中酶的失水与溶剂的疏水参数（LogP）和介电常数有关，与系统中底物的极性、底物浓度和含水量均有关系。,2.有机溶剂对底物和产物的影响,从微观上看，酶催化反应过程中，底物分子必须首先从有机溶剂中进入酶蛋白的必需水层中，与酶形成底物酶复合物后进行酶促反应，反应后产物从水层中移出再进入有机相。,3.有机溶剂对酶的影响,（1）溶剂的极性,相同的酶在不同的有机溶剂中酶活力的不同说明，有机溶剂的性质与酶活力之间存在着一定的规律。,最常用、最可靠的方法是：用有机溶剂极性参数LogP描述有机溶剂的极性与酶活力之间的关系。P值为某溶剂在正辛醇和水中的分配系数。LogP越大，溶剂的疏水性越强，LogP越小，溶剂的亲水性越强。,logP混合=X1 logP1+X2 logP2,Laane规律,并不是所有的情况都符合Laane等人提出的规律。,（2）有机溶剂对酶结构、活性中心的影响,尽管在有机溶剂中酶的总体结构和活性中心的结构都是保持完整，但是酶分子本身的动态结构、表面结构和活性中心发生了变化。,与有机溶剂对酶分子的动态结构、表面结构相比，对酶的活性中心影响所引起催化功能的改变更加敏感和重要。,（3）有机溶剂对酶活性和选择性的调节,1）有机溶剂对酶活性的调节,酶在有机溶剂中所表现出的催化活力要比在水相中低。,2）有机溶剂对酶选择性的调节,同一种酶在不同溶剂中，对映体的选择性也有不少差异。,选择有机溶剂的原则,（1）有机溶剂对必需水的影响，也就是溶剂的疏水性和亲水性质会对每产生影响（2）对底物的影响（3）应属于“惰性”，不应参加反应（4）在整个生物催化的下游过程中的分离与纯化的难程度,10.1.5 有机溶剂酶促反应动力学,1.有机溶剂中酶促催化机制,有机相中酶促反应的过程、机制与常规情况相同，复合米氏方程、乒乓机制。,Klibanov采用同位素标记底物的方法证明枯草芽孢杆菌蛋白酶催化过程的过渡态与反应介质的性质有关。,非水相体系对酶反应速度的影响,（1）底物、产物和其他效应物在载体之间的迁移扩散速度受到限制（2）由于载体的疏水亲水及电荷性质使固定化酶的微环境与宏观反应体系不同（3）若使用固定化酶，酶分子在固定化过程中的扭曲影响三维构象,2.有机溶剂如何影响表观米氏常数,首先，酶活性位点与底物结合，包括底物脱溶剂过程。还应包括酶活性位点上有机溶剂的脱离。底物与有机溶剂相互作用的越紧，酶的活性位点与底物的结合越不利。,水活度或水含量的增加会导致酶催化反应中某种底物Km值的变化。,非水介质中酶催化的主要影响因素,有机介质中酶催化反应的条件及其控制,酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。主要应控制的条件有酶的种类和浓度底物的种类和浓度有机溶剂的种类水含量温度pH离子强度,本章目录,10.2 非水介质中酶催化反应的应用,手性药物两种对映体的药理作用,1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。许多国家和地区也都制定了有关手性药物的政策和法规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应用。目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一对映体药物占绝大多数。,脂肪酶-位置选择性酯化反应,葡萄糖苷-6-O-酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到：,糖酯的合成,脂肪酶-消旋化合物选择性酯化,以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸为原料，在有机溶剂介质中用脂肪酶(CCL)或猪肝酯酶（PLE）催化酯化反应，可得到较高光学纯度的R-或S-酯。,脂肪酶-消旋化合物的拆分,有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于-羟基-,-不饱和酯的拆分。可以避免副反应的发生。,脂肪酶-内酯合成反应,-羟基酸或它的酯在脂肪酶催化下，发生分子内环化作用得到内酯化合物。内酯可继续反应形成开链寡聚物.内酯化产物形式主要取决于羟基酸的长度外，也取决于脂肪酶的类型、溶剂及温度等。,生物柴油,生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。,生物油脂的来源：菜子油，豆油，椰子油，棕榈油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽 油，废食用油等,优点：（1）具有良好的环境属性（2）具有较好的低温发动机启动性能。（3）具有较好的润滑性能。（4）具有较好的安全性能。（5）具有良好的燃料性能。（6）具有可再生性能。,从生物质到生物柴油,生物柴油生产装备,美国生物柴油发展趋势,生物柴油的生产方法,目前生物柴油主要是用化学法生产，采用酸、碱催化油脂与甲醇之间的转酯反应，而生成脂肪酸甲酯。反应时间短，成本低。但在反应过程中使用过量的甲醇，而使后处理过程变得较为繁杂。能耗高；色泽深，在高温下容易变质；酯化产物难于回收；生产过程有废碱液排放。新方法：生物酶法，在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子醇类的酯交换反应，生成小分子的酯类混合物。条件温和，醇用量小、无污染排放。缺点：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%60%，酶的使用寿命短。副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。,