《酶生物合成的调节》PPT课件.ppt

Chapter 3 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism,微生物发酵产酶,酶的生产方法,提取分离法(Extraction),生物合成法(Biosynthesis),化学合成法(chemicalsynthesis),SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cell,Amylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from AspergillusPlant cell cultureAnimal cell culture,Few example,酶的生产：指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程,一、提取分离法,酶的提取：在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。主要提取方法：盐溶液提取酸溶液提取碱溶液提取有机溶剂提取等,注意选择适当的溶剂！,优点：提取方法简单方便缺点：必须先获得含酶组织或细胞受气候环境影响若培养细胞则工艺路线变复杂产品含杂质较多，分离纯化较困难,适用范围,在动植物资源丰富的地区从动物胰脏中提取各种胰蛋白酶，小肠中提取碱性磷酸酶,二、生物合成法（发酵法）,利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术。,酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程。,1、固体培养发酵,培养基以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或半固体的曲麸，经过灭菌、冷却后，接种产酶微生物菌株，在一定条件下进行发酵，以获得所需的酶。,优点：设备简单，操作方便。麸曲中酶的浓度特别高，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产物。缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产周期长。,2、液体深层发酵,将液体培养基置于生物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定的条件下进行发酵，生产得到所需酶。优点：机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率较高，质量较稳定，产品回收率较高。是目前酶发酵生产的主要方式。,优点：生产周期短酶的产率较高不受资源限制缺点：对发酵设备和工艺条件要求较高,三、化学合成法,是一种新兴技术局限性单体底物要求纯度高成本高昂只能合成已经清楚化学结构的酶,化学合成法新进展,模拟酶,第一节 酶生物合成过程及调节,1、中心法则-Central Dogma,Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。Translation 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。Reverse translation 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,2、RNA的生物合成(转录)-Transcription,细胞内RNA的生物功能,(1)在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。,(2)在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。,(3)某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。,(4)各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。,转录过程的特点,1、转录的不对称性,反义链 antisense strand（无意义链，负链）有义链 coding strand（编码链，正链）,2、转录所需酶,转录过程,起始位点的识别 recognition转录起始 initiation链的延伸 elongation转录终止 termination转录后加工 modification,The E.coli RNA polymerase holoenzyme consists ofsix subunits:a2bb s.,Possible catalytic subunits,Promoterspecificity,Enzyme assembly,promoter recognition,activator binding,Role unknown(not needed in vitro),36.5 kDa,151,155,11 kDa,(32-90 kDa),转录的起始,核心酶与因子结合成全酶,全酶与DNA模板结合生成不稳定复合物，沿模板移动寻找到启动子,生成酶与启动子复合物,DNA双螺旋部分解链,因子释放,转录延伸,RNA链合成的终止,RNA聚合酶到达终止密码子，RNA与酶从DNA上脱离，RNA链合成终止,RNA前体的加工,剪切反应剪接反应末端连接反应核苷修饰反应,3、蛋白质的合成(翻译)-Translation,翻译:以RNA中mRNA为模板,按照其 核苷酸顺序所组成的密码指 导蛋白质的合成的过程.,mRNA,蛋白质,翻译,各种信息 各种蛋白质,（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）,蛋白质合成的几个要素-mRNA(模板，template),mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过程(翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。,蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotide triplet codon,mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。其中：一个起始密码:AUG三个终止密码:UAA UGA UAG多数氨基酸拥有 2-4个密码,蛋白质合成的几个要素-转运RNA(transporter),tRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。tRNA有特异性，至少有20种以上。每种tRNA的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应的密码互补结合。,酪,5,5,3,AUG,GUU UAC ACA,酪氨酰-tRNA,反密码,mRNA,密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对,蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosome,核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。,The ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic cell,蛋白质合成的几个要素-其他因子和酶,其他辅助因子工具酶,蛋白质的合成过程,肽链合成的起始 initiation肽链合成的延伸 elongation肽链合成的终止与释放 termination and release合成多肽的输送和加工 transport and modification蛋白质分子的折叠 folding,氨基酸活化生成氨酰-tRNA,反应式,A.A+tRNA+ATP,氨酰tRNA合成酶,氨酰-tRNA+AMP+PPi,一般而言，原核生物的第一个氨基酸是甲酰甲硫氨酸，起始tRNA是fMet-tRNAF。真核生物的第一个氨基酸是甲硫氨酸，起始tRNA是Met-tRNAMET。,蛋白质合成起始,30 S亚基+IF3,mRNA,30S-IF3-mRNA复合物,fMet-tRNAF+IF2+GTP,fMet-tRNAF-IF2-GTP,IF1,30S起始复合物,70S核糖体,IF1、IF2、IF3GDP+Pi,肽链的延伸,合成终止,高效率的蛋白质合成体系,4、酶生物合成的调节(regulation),组成酶：DNA酶，RNA酶，糖酵解途径的酶（与生长发育条件无关，常进行定量合成的酶）调节酶：适应酶，-半乳糖苷酶（诱导酶）,酶的类型,A B,E,X,底物水平的调节,酶水平的调节,酶活性的调节,酶含量的调节,酶的定位调节,辅助因子调节,生长发育的不同时期外界环境变化酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）,产物调节,细胞内酶的调控模式,1960年Jacob和Monod提出的操纵子学说,调节基因(R)：产生阻遏蛋白启动基因(P)操纵基因(O)：与阻遏蛋白结合结构基因(S)：蛋白多肽链产物,操纵子,1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点,（1）操纵子学说,操纵子学说 莫诺与雅可布最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙的自动控制系统，这个自动控制系统负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。乳糖可作为培养大肠杆菌的能源。大肠杆菌能产生一种酶（叫做“半乳糖苷酶”），能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，以便作进一步的代谢利用。编码半乳糖苷酶的基因（简称z）是一个结构基因。这个结构基因与操纵基因共同组成操纵子。操纵基因受一种叫作阻遏蛋白的蛋白质的调控。当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时，乳糖会起诱导作用，它与阻遏蛋白结合，使之从操纵基因上脱落下来。这时，操纵基因开启，相邻的结构基因也表现活性，细菌就能分解并利用乳糖了，这样，乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的诱导物。60年代中期，在操纵子中还发现了另一个开关基因，称为启动基因。启动基因位于操纵基因之前，二者紧密相邻。启动基因由环腺苷酸（cAMP）启动，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这样，葡萄糖便通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因，使结构基因失活，停止合成半乳糖苷酶。由此可知，结构基因同时受两个开关基因操纵基因与启动基因的调控。只有当这两个开关都处于开启状态时，结构基因才能活化。当培养基中同时存在葡萄糖和乳糖时，葡萄糖通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因，并进而抑制结构基因，使细菌不产生半乳糖苷酶。这种情况下，细菌便会自动优先利用葡萄糖，因为葡萄糖果是比乳糖更好的能源。,调节基因,启动基因,操纵基因,结构基因,与阻遏蛋白结合,1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点,产生阻遏蛋白,mRNA,操纵子,诱导型操纵子无诱导物不表达或低表达、有诱导物转录成mRNA合成酶阻遏型操纵子无诱导物正常表达有诱导物转录受阻,（2）原核生物中酶生物合成的调节机制,a.分解代谢物阻遏作用,b.酶生物合成的诱导作用,c.酶生物合成的反馈阻遏作用,a.分解代谢物阻遏作用,是指容易利用的碳源经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。,葡萄糖过量降解,ATP,ADP,AMP,cAMP-CRP,启动基因上没有 cAMP-CRP结合,酶合成,例：葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成,实质：cAMP通过启动基因对酶生物合成进行调节控制。,b.酶生物合成的诱导作用,加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程。,举例：乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成,c.酶生物合成的反馈阻遏作用（产物阻遏作用）,是指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程。,举例：无机磷酸阻遏碱性磷酸酶,磷酸单酯 磷酸+醇,碱性磷酸酶,（3）酶生物合成的模式,细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。,a、同步合成型,酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（）。,属于同步合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/ml,特点：该类酶所对应的mRNA很不稳定，其寿命一般只有几十分钟，细胞进入平衡期后，新的mRNA不再生成，原有的mRNA被降解，酶生物合成停止。mRNA不稳定，无阻遏作用,b、延续合成型,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，）的生物合成。,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/ml,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/ml,以半乳糖醛酸为诱导物,以含有葡萄糖的果胶为诱导物,特点：这些酶所对应的mRNA相当稳定，在平衡期后仍 可合成相对应的酶mRNA稳定，不受阻遏,c.中期合成型,该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/ml,特点：酶的生物合成受产物或分解代谢产物阻遏作用，而酶对庆的mRNA稳定性较差mRNA不稳定，受阻遏,d.滞后合成型,此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。,黑曲霉羧基蛋白酶生物合成,放线菌素D 对产酶的影响,细胞浓度mg/ml,酶浓度U/ml,酶浓度U/ml,酶浓度U/ml,30,22,不加,加入,不加,加入,mRNA稳定，受阻遏作用,理想的酶合成模式,酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。,在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。,改良方法：,同步合成型尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；滞后合成型的酶设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；中期合成型的酶在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。,