《酶学基本原理》PPT课件.ppt

第二章 酶学基本原理,The basic theory of enzyme,酶-催化生命,3,第一节 酶的分类、组成,一、酶的命名与分类二、酶的组成,第二节 酶的结构与功能,4,一、酶的命名与分类1、酶的命名,(1)系统命名法：包括所有底物的名称和反应类型。,乳酸+NAD+,丙酮酸+NADH+H+,乳酸：NAD+氧化还原酶,(2)习惯命名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。,乳酸：NAD+氧化还原酶,乳酸脱氢酶,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。,5,(3)EC 命名法,Each enzyme is now classified and named according to the type of chemical reaction it catalyzes.So an enzyme is assigned a four-number classification and a two-part name called a systematic name.In addition recommended name is suggested by IUB for everyday use.,6,2、酶的分类,1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：,7,氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,酶的分类1:氧化还原酶 Oxidoreductase,系统命名：供体：受体氧化还原酶推荐命名：（1）供体脱氢酶（2）受体氧化酶,8,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如:谷丙转氨酶催化的氨基转移反应,酶的分类2：转移酶 Transferase,系统命名：供体：受体某基团转移酶推荐命名：受体（供体）某基团转移酶,9,酶的分类3:水解酶 hydrolase,水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,系统命名：底物+化学键位置+水解酶推荐命名：底物+酶,10,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如:延胡索酸水合酶催化的反应,酶的分类4：裂合酶 Lyase,系统命名：底物+裂解基团+裂合酶推荐命名：裂解底物+脱（基团）酶,11,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如：6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应,酶的分类5：异构酶 Isomerase,推荐命名：底物+异构酶,12,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H=A-B+ADP+Pi 例如：丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2 草酰乙酸,酶的分类6：合成酶 Ligase or Synthetase,系统命名：底物：底物连接酶酶推荐命名：合成产物+合成酶,13,核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及逆反应。(to RNA flase),新酶1：核酸酶 Ribozyme,14,抗体通过对抗原的包裹、降解等作用使抗原失活，其生物特性十分类似于酶。（to antibody flash）,新酶2：抗体酶 Antibody,15,二、酶的组成：酶蛋白、辅酶（coenzyme）辅基和金属离子,根据酶的组成情况，可以将酶分为两大类：单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质.结合蛋白酶：某些酶，例如氧化-还原酶等，其分子中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分.结合蛋白酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分包括辅酶、辅基及金属离子(统称为辅因子cofactor)。全酶：酶蛋白与辅因子组成的完整分子称为全酶。单纯的酶蛋白无催化功能.,16,辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以是无机离子也可以是有机化合物。,与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。,全酶的结构,18,辅酶在酶促反应中的作用,辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型的反应。同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。,19,酶分子中的金属离子,根据金属离子与酶蛋白结合程度，可分为两类：金属酶和金属激酶。在金属酶中,酶蛋白与金属离子结合紧密。如 Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3、Zn2+、Mn2+、Co2 等。金属酶中的金属离子作为酶的辅助因子，在酶促反应中传递电子，原子或功能团。,20,金属酶中离子催化作用,金属离子可以和水分子的OH-结合，使水显示出更大的亲核催化性能。许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。,提高水的亲核性能,21,电荷屏蔽作用,电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。多种激酶(如磷酸转移酶)的底物是Mg2+ATP复合物。,22,电子传递中间体,23,金属激酶中的金属离子,激酶是一种磷酸化酶类，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。其中的金属离子与酶的结合一般较松散。在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。如Na+、K+、Mg2+、Ca2+等。金属离子对酶有一定的选择性,某种金属只对某一种或几种酶有激活作用。,24,第二节 酶的结构与功能,一、酶蛋白质的结构二、活性中心与必需基团三、催化机制,第三节 酶动力学,25,一、酶蛋白的结构,除少数核酶之外几乎所有的酶都是蛋白质蛋白质是由20种天然氨基酸构成的生物大分子具有不对称碳原子，均是L-构型，但苷氨基酸例外酶具有蛋白质的四级结构,26,1、酶蛋白的一级结构,一级结构：多肽链的氨基酸残基的排列顺序。它是由基因上遗传密码的排列顺序所决定的。每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级三级等高级结构，这就是荣获诺贝尔奖的著名的Anfinsen原理。,27,胰岛素的一级结构及不同动物胰岛素在A链中的差异,胰岛素（Insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链21个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过两个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。,28,2、酶的二级结构,二级结构：指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性的结构的构象，是多肽链局部的空间结构（构象）二级结构形式：螺旋、折叠、转角和无规则卷曲等,29,螺旋(helix),同一肽链上的每个残基的酰胺氢原子和位于它后面的第4个残基上的羰基氧原子之间形成氢键。,30,折叠(sheet),可分为平行式和反平行式两种类型，它们是通过肽链间或肽段间的氢键维系,在平行（A）和反平行（B）折叠片中氢键的排列,31,32,转角(turn),在转角中第一个残基的C=O与第四个残基的N-H，以氢键键合形成一个紧密的环状稳定结构多处在蛋白质分子的表面,在这里改变多肽链方向的阻力比较小。,两种主要类型的转角,33,蛋白质的二级结构,34,3、酶的三级结构,三级结构：指整条多肽链由二级结构元件构建成的总三维结构，包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系,骨架和侧链在内的所有原子的空间排列。,胰岛素的三级结构,35,磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构,36,4、四级结构（quaternary structure）,根据酶蛋白分子的特点，可将酶分为以下几类：1.单体酶（monomeric enzyme)：一般由一条多肽链组成，如溶菌酶；但有的单体酶是由多条肽链组成，肽链间二硫键相连构成一整体。2.寡聚酶(oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。3.多酶复合物(multienzyme system)：几种酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。,37,38,四级结构：在亚基和亚基之间通过疏水作用等次级键结合成为有序排列的特定的空间结构。四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基,亚基通常由一条多肽链组成，有时含两条以上的多肽链，单独存在时一般没有生物活性,血红蛋白的四级结构,39,二、活性中心与必需基团,必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。,活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。,专一性,40,A结合部位 Binding site酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。,1、酶分子结构特点,41,42,酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。,B、催化部位 catalytic site,43,酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。,C、调控部位 Regulatory site,44,主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。,2、酶活性中心 的必需基团,45,酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。,46,三、酶催化作用机制1、酶催化作用特点（1）高度专一性,酶的专一性,结构专一性,立体结构专一性,绝对专一性,族的专一性,键的专一性,旋光异构专一性,几何异构专一性,47,（2）催化效率高催化转换数：每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。酶催化的转换数一般为103min-1左右。比非催化高1081020；比非酶催化的反应速度高1071013倍。碳酸酐酶最高为3.6*107min-1（3）催化条件温和 一般在常温、常压及pH接近中性条件下进行,48,2、酶作用专一性的机制,酶分子活性部位，一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应可以按单一方向进行。酶能够区分对称分子中等价的潜手性基团。,49,A、“三点结合”的催化理论,认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。,50,B、锁钥学说 Lock&Key theory,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,51,C、诱导楔合学说,酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导，酶才形成了互补形状.,52,（3）酶作用高效率的机制,*中间产物学说 在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后中间复合物再分解成产物和酶。E+S=E-S P+E许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。,53,54,55,56,酶促反应：E+S=ES EP E+P反应方向,即化学平衡方向,主要取决于反应自由能变化H。而反应速度快慢则主要取决于反应的活化能Ea。催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用,*降低活化能,57,反应过程中能的变化,58,酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力(如氢键,离子键和疏水键等)的作用，形成E-S反应中间物。其结果使底物的价键状态发生形变或极化，起到激活底物分子和降低过渡态活化能作用。,59,第三节 酶动力学,一、米氏方程二、抑制作用（一）可逆抑制作用（二）不可逆抑制作用,60,一、米氏方程,当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2 Vmax,Km=S 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度，单位为mol/L。,Km 为米氏常数，Vmax为最大反应速度,61,米氏常数Km的意义,不同的酶具有不同Km值，是酶的一个特征物理常数。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。,62,米氏常数的求法：双倒数作图法,斜率=Km/Vmax,-1/Km,1/Vmax,1 Km 1 1=+V Vmax S Vmax,63,二、抑制作用,可逆性抑制：抑制剂与酶的结合是可逆的，只要 除去抑制剂，酶活即可全部或部分 恢复。,酶抑制作用,不可逆性抑制：抑制剂与酶结合后抑制剂难于 除去，酶活性不能恢复,64,酶的可逆抑制作用,竞争性抑制（competitive inhibition）：抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。,65,例:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用,竞争性抑制的效果与竞争性抑制剂的浓度、底物浓度及抑制剂和底物与酶的亲和力大小有关。,66,竞争性抑制作用,竞争性抑制剂的特点：酶催化反应的的最大Vm不变，而米氏常数Km增大,67,非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）：是指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，引起酶活性降低的抑制作用。,68,非竞争性抑制作用,特点：反应最大反应速度Vm减小，米氏常数Km不变。,69,反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合引起的抑制作用。,70,反竞争性抑制,特点：反应最大反应速度Vm和米氏常数Km同时减小。,71,不可逆抑制,抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,72,第四节 影响酶催化反应的因素,一、底物浓度的影响二、酶浓度对反应速度的影响三、温度对酶反应的影响四、pH五、激活剂的影响六、抑制剂的影响七、作用时间的影响八、工艺及设备,73,一、底物浓度对酶反应速度的影响,米氏方程,74,二、酶浓度对酶反应速度的影响,SEVE,条件：底物过量时，由E+S=ES-E+P 得：V=k3/k2ES=k3ES=k3EV=k3E,k1,k3,k2,75,三、温度对酶反应速度影响,每种酶的催化反应都有其最适宜的温度温度对酶的作用分两个方面：a.温度升高引起酶失活速度加快。b.温度升高使酶反应速度加快。,76,四、pH对酶反应速度的影响,酶的最适pH不是一个固定常数。它受到底物的种类、浓度;缓冲液的种类、浓度;酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。pH影响反应速度的原因:a.pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的解离状态。b.过高或过低的pH使得酶分子变性,77,五、激活剂的影响,激活剂:能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质。酶激活剂：a.无机离子一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN-等 氢离子b.有机分子c.具有蛋白质性质的大分子，如酶原可被一些蛋白酶激活，蛋白酶可看作为激活剂。,78,六、酶抑制剂的影响,酶抑制剂：能够使酶活性降低或丧失的物质。有些酶抑制剂是细胞正常代谢物质，它可作为一种抑制剂在细胞代谢调节中起作用。大多数抑制剂是外源物质主要包括：各种无机离子、小分子有机物和蛋白质等。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：A.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。B.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,79,第五节 酶活性的测定,一、酶基本概念二、酶催化活性测定的原理三、操作要求,80,一、酶活基本概念,1、定义：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示（U/g或U/ml）。2、酶活单位：国际酶活单位：1961年国际酶学委员会规定“国际单位”表示酶活力：在特定条件下（温度可采用25或其它选用的温度，pH等条件均采用最适条件），每1min 催化1mol 的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。这个单位称为国际单位（IU）。Katal单位：一个katal单位是指在最适反应条件下，每秒钟催化1moL底物转化为产物所需要的酶量。1Kat6107IU，1IU=16.7nKat,81,3.酶的比活力（specific activity）酶的比活力代表酶的纯度，以每mg蛋白质所含有的酶活力单位数表示。对同一种酶来说，比活力愈大，纯度愈高。4.酶的转换数：kp 每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的一个指标。单位min-1,82,二、酶活测定步骤：,反应体系选择/反应条件确定将酶与底物混合记下反应开始和结束时间。反应物检测/酶活力计算终止反应方法：沸水浴加热使酶失活加入酶变性剂使酶失活加入酸或碱使酶反应停止置于低温冰箱或冰盐水中使酶反应停止,83,三、酶活测定的操作要求,1、恒温2、准确计时3、恒定缓冲液的pH及离子强度4、空白参照5、定量测定酶活,84,定量测定酶活的方法,1、酸碱滴定2、气相色谱3、分光光度法4、放射性同位素5、碘量法6、测压法,