《酶分子化学修饰》PPT课件.ppt

第8章 酶分子的化学修饰,Chemical Modification of Enzyme Molecule,酶的活性中心酶化学修饰的目的酶化学修饰的基本原理酶化学修饰的方法学酶化学修饰的种类修饰酶的化学性质酶化学修饰的应用和局限性,主要内容,一、活性中心的概念 酶的必需基团(essential group):与酶活性有关的基团 酶的活性中心(active center):由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域,第一节 酶的活性中心（active site）,酶分子,非必需基团,必需基团,Active site The active site is the region of the enzyme that binds the substrate,to form an enzyme-substrate complex,and transforms it into product.The active site is a three-dimensional entity,often a cleft or crevice on the surface of the protein,in which the substrate is bound by multiple weak interactions.,7种氨基酸出现的频率最高:Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser（兰天果拌猪肉丝）某些功能基团（如氨基、羧基、巯基、咪唑基 和羟基）是酶的必需基团。,活性中心的重要化学基团,半胱氨酸,谷氨酸,丝氨酸,组氨酸,天冬氨酸,赖氨酸,酪氨酸,二、酶活性中心的共性,(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一个三维实体。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。,1.物理学方法2.化学修饰法3.动力学参数法4.蛋白质工程,三、研究酶活性中心的方法（P13）,用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。,1.物理学方法,2.化学修饰法 根据所用修饰试剂不同，分为:1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基团,但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。,活性中心基团的鉴定标准 失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。先加S或竞 加共价修饰剂 透析除去S或竞 活性不丧失,差别标记底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。,化学修饰,含同位素标记,的同样试剂,2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。3)亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。,亲和修饰剂：与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。,3)亲和标记（位点专一性修饰）,化学修饰的专一性,3.动力学参数法 pH-酶活力关系的研究，可得到参与反应的必需基团的pK值，通过比较分析估计基团的种类。4.蛋白质工程 将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。,一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因：1)易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；2)容易受产物和抑制剂的抑制；3)工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；4)底物不溶于水，或酶的米式常数过高；5)酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。,第二节 酶化学修饰的目的,1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。蛋白质水平2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。核酸水平,2.改变酶特性的两种主要方法：,酶的化学修饰（chemical modification）通过化学基团的引入或除去，使酶的共价结构发生改变。酶的选择性化学修饰：在较温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基发生共价的化学改变。,3.酶化学修饰的概念,1.研究酶的结构与功能的关系（50年代末）探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶纯度的分析与检测,二、酶化学修饰的目的,2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。,二、酶化学修饰的目的,一、增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联，使酶的天然构象产生“刚性”结构。二、保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。,第三节 酶化学修饰的基本原理,酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子，“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。,三、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶,1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。,四、消除酶的抗原性及稳定酶的微环境,一、充分认识酶分子的特性 包括酶的 1.活性部位情况 2.稳定条件及反应最佳条件 3.侧链基团的化学性质及反应活泼性,第四节 酶化学修饰的方法学,要考虑 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件,二、修饰剂的选择,要注意 1.酶与修饰剂的分子比例 2.反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3.反应温度及时间,三、反应条件的选择,一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）（三）交联修饰（交联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（二）氨基酸置换修饰（三）金属离子置换修饰,第五节 酶化学修饰的种类,（一）大分子修饰（大分子结合修饰）P295 定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、糖肽（glycopeptide）等。修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。,1.聚乙二醇的修饰反应聚乙二醇（PEG）：线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，可消除酶分子的抗原性，广泛用于酶的修饰。PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改变，产生许多有用的性质，如可在广泛的pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降等。修饰方法：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均嗪法、羰二亚胺法、重氮法。,(1)叠氮法,(2)琥珀酸酐法,（3）三氯均嗪法,（4）羰二亚胺法,（5）重氮法,2.糖类的修饰反应：(1)右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应右旋糖苷：-葡萄糖通过-1,6-糖苷键连接而成，双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法。,(2)糖肽（Glycopeptide)的修饰反应:糖肽：人纤维蛋白或-球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，分子上的游离氨基活化后可与酶分子上的氨基反应。修饰方法：2,3-异氰酸甲苯活化法、戊二醛法。,(3)聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上氨基反应。,3.其他大分子多聚物的修饰反应(1)聚N-乙烯吡硌烷酮(PVP):用水溶性的分子量为10,000的PVP，经过开环水解活化后，与酶结合。(2)聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。(3)聚丙烯醇(PAA):用分子量为250,000的PAA，经过N-羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。(4)聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98,000的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。(5)聚氨基酸：用分子量为5,700的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。,聚丙烯醇(PAA)修饰酶:,4.天然大分子对酶的修饰反应(1)肝素：由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为20000，是一种含硫酸酯的黏多糖。经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。修饰方法：羰二亚胺法、三氯均嗪法、溴化氰法(2)人血清白蛋白：相对分子质量大修饰方法：戊二醛法、羰二亚胺法、活性酯法,5.大分子修饰酶的应用 PEG超氧化物歧化酶（SOD）PEG溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）PEG天门冬酰胺酶（ASNase）消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期 用Dextran修饰-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。,（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）P285 定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。,根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。非极性R基氨基酸（共8种）：丙氨酸(Alanine,Ala,A),亮氨酸(Leucine,Leu,L),缬氨酸(Valine,Val,V),异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸(Methionine,Met,M),脯氨酸(Proline,Pro,P),无电荷的极性R基氨基酸（共7种）：丝氨酸(Serine,Ser,S),苏氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q),带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）：赖氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),组氨酸(Histidine,His,H)带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E),烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应,几种重要的修饰反应：,1.化学修饰反应的类型,1)烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。,烷基化反应,2)酰基化反应试剂特点：含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）,酰基化反应,3)氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基、甲硫基、吲哚基、咪唑基、酚基等。还原剂：2-巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。,连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。,4)芳香环取代反应 试剂：卤（碘）化、硝化试剂,（四硝基甲烷）,2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1)氨基的化学修饰：来源：Lys、Arg、His修饰反应：酰基化、烷基化酰基化修饰剂:三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修饰剂：2,4-二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等,三硝基苯磺酸,2,4-二硝基氟苯,碘乙酸,2)羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定量测定酶分子中羧基的数目。,3)胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：丁二酮 二羰基化合物 1，2环己二酮 苯乙二醛,4)巯基的化学修饰 来源：Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)E-SH+R-X E-SR+HXN-乙基马来酰亚胺（NEM）:常用的专一修饰巯基试剂ESH,5)二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）,6)咪唑基的化学修饰 来源：His 修饰反应:酰基化、烷基化 酰基化修饰剂:焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）+C2H5OH+CO2 烷基化修饰剂：碘乙酸,+ICH2COOH+HI,7）酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）,8）吲哚基的化学修饰 来源：Trp 修饰反应：氧化反应 修饰剂：N-溴代琥珀酰亚胺,各种氨基酸侧链的修饰剂,对修饰效果的解释须十分小心：任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团不易被修饰。,（三）交联修饰（交联法）分子内交联：提高酶稳定性的有效方法之一例：胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。分子间交联：形成杂化酶例：用戊二醛交联胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型，可在体内将它们输送到同一部位而提高药效。,（四）固定化修饰（共价偶联法）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。,（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）P285,蛋白主链修饰利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。采用酶法 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。,酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1.引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2.仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3.有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。,应用实例1）提高酶活力：,胃蛋白酶原的激活,天门冬氨酸切除10个氨基酸残基，可使其活力提高4-5倍。,胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,2）消除抗原性一般大分子的外源蛋白抗原性较强，经肽链有限水解，降低分子量，抗原性显著降低，甚至消失。木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去了2/3肽链，酶活性不变，抗原性大大降低。,肽链上氨基酸发生置换，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能。方法：化学修饰法、蛋白质工程,（二）氨基酸置换修饰,1.化学修饰法,例：利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。,2.蛋白质工程：利用基因操纵技术。定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析,改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变。例：-淀粉酶中的钙离子(Ca2+)，谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+、Zn2+)从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。,（三）金属离子置换修饰,第六节 修饰酶的化学性质,一、热稳定性：一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性（表6-1）。二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好（表6-2）。,三、对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然酶相比，对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（表6-3）。四、修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长（表6-4）。五、最适pH:大多数酶经化学修饰后，最适pH发生了变化，这在应用上具有重要意义（表6-5）。六、Km 的变化:有些酶经化学修饰后，Km变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。（表6-6）,第七节 酶化学修饰的应用和局限性,一、酶化学修饰的应用 医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐受性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学性质。,酶结构功能研究：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。,二、酶蛋白化学修饰的局限性,1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。,4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。,思考题：,1.酶活性中心的共性是什么？2.名词解释：酶分子化学修饰3.酶分子的化学修饰方法有哪些？4.化学修饰剂与酶蛋白反应的类型有哪些？5.酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修饰反应有哪些？6.分析说明修饰酶的性质。,表6-1 天然酶和修饰酶的热稳定性比较,表6-2 修饰酶的抗原性变化,表6-3 天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较,表6-4 天然酶与修饰酶的半衰期比较,表6-5 天然酶与修饰酶的最适pH,表6-6 天然酶与修饰酶的Km值,