《酶免测定技术》PPT课件.ppt
酶免疫测定技术,广州医学院第一附属医院检验科廖伟娇,概述,1 标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术 2 标记免疫技术的分类：按标记物分类：同位素标记 荧光素 酶标记 等等按检测对象分类：免疫组织化学技术 免疫测定技术,酶免疫测定技术概述：1.酶免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种免疫技术，称为酶标记免疫技术。2.分类：酶免疫组化 酶免疫测定 均相法 异相法 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法 则需分离后测定,均相酶免疫测定：1.EMIT(酶扩大免疫测定技术):2.克隆酶供体免疫测定：,位阻,ED,ED,EA,EA,ED,Ab,Ab,活性酶,标本中Ag,酶联免疫吸附试验(ELISA),第一节ELISA的原理和类型一、基本要求：1.使Ag(或Ab)结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性。免疫吸附剂2.使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性，又有酶的活性。酶结合物3.标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有色反应。底物,二、必备试剂：固相的Ag或Ab-免疫吸附剂酶标记的Ab或Ag-结合物酶反应的底物-底物三、方法类型：夹心法间接法竞争法捕获法测IgM抗体,标本,标本,酶标抗体,底物,显色有色为阳性,显色有色为阳性,酶标二抗,底物,3.竞争法 Ag AgAb+Ab Ag(标本)(定量)AgAb,E,E,终止液,标本,酶标抗体,底物,显色,显色,固相,固相,标本,酶标二抗,底物,1.夹心法,2.间接法,第二节 ELISA的技术要点一、试剂制备 免疫吸附剂 酶标记抗原或抗体二、反应条件的选择 酶标二抗浓度选择 包被抗原浓度的选择三、操作标准化,一、试剂制备：免疫吸附剂固相载体 要求：吸附力强 能保持Ag或Ab活性 不参与化学反应 载体性能比较 载体材料：+、-结果差别大 ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10%。,常用载体：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板2.Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高3.免疫吸附剂(固相Ag或Ab)：包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液、包被方法 封闭：包被后在用15%小牛血清白蛋白再包 被，以消除非特异吸附的干扰。,酶结合物：1.酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。2.ELISA常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3.酶的底物：HRP可溶性底物及呈色：邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm)5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2：荧光HRP不可溶性底物及呈色：DAB(棕黄色)-萘酚(红色)，3-氧基-9-乙基卡唑(红色)4-氯-1-萘酚(灰蓝色),AP可溶性底物及呈色：对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光 Ap不可溶性底物及呈色：NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色-半乳糖苷酶：4-甲基伞基-半乳糖苷：荧光4.酶结合物的制备：戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法,二、反应条件的选择酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标二抗，取OD=0.8者。包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法3.温度、时间等三、操作标准化 1 加样 2 保温 3 洗涤 4 比色,四、影响ELISA测定的因素：试剂盒因素实验操作中的影响,试剂盒因素：A 固相材料：孔间不均B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗原(与片段的选择和制备水平有关)C 酶结合物D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光)TMB：水溶性差(商品：配好)E 运输储存,操作中的注意事项：1 标本的收集和保存试剂的准备加样温育洗板显色比色结果判断,样品的收集和保存：1.溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用 于HRP的辅基)。2.细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”(破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白)。3.反复冻融可使抗体效价下降而假“-”。4.陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本 底增 加。5.标本用NaN3防腐，可出现假“-”。,试剂的准备：注意不同地区冬、夏温差，可造成达到37的时间差异，对弱阳性结果有很大影响。,加样：总体积约360ul，包被和封闭均为100ul，未封闭部分可吸附非特异蛋白,温育：4过夜最佳，372h较好，4320min可造成弱“+”假“-”2 水浴较温箱等空气浴均匀,洗板：手洗效果最佳 自动洗板要注意残留液量。,显色对HRP，显色完全需30min,15min只达80%,易造成弱“+”假“-”,比色：单波长比色需设空白孔：OD=OD样品-OD空白双波长比色不需设空白：OD=OD450nm-OD630nm,结果判断：1 注意夹心法假“-”2 用cut-off(CO)值判断 3“灰区”时建议动态观察 4 结合临床用药：例如抑制剂对HBsAg,五.ELISA出现“一片黄”的原因：酶结合物浓度过高 底物不新鲜 洗涤不干净六.ELISA出现“一片白”的原因：载体吸附性能差 底物错 稀释液作包被液 加错试剂 包被时间过短 酶活力低或下降 样品含有NaN3。,第三节 酶标记技术的发展一、斑点ELISA二、免疫印迹法三、重组免疫结合试验四、亲和素-生物素系统,
