《酵母表达系统》PPT课件.ppt

真菌基因工程,三、酵母表达系统,二、酵母转化系统,一、真菌表达系统的优缺点,四、丝状真菌表达系统,三 酵母表达系统,甲醇酵母表达系统,酿酒酵母表达系统,其它酵母表达系统,（一）酿酒酵母表达系统,酿酒酵母分泌系统,酿酒酵母系统启动子,酿酒酵母表达系统存在的问题,酿酒酵母糖基化系统,1、酿酒酵母启动子,UAS,URS,TATA,起始位点,编码序列,mRNA,40-120bp,20-40bp,100-1400bp,1、转录起始位点；4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT；5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列;,DAS,1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH,酿酒酵母表达系统常用启动子,2）半乳糖激酶启动子（GAL1）,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,A、GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差,半乳糖诱导、葡萄糖抑制,2）半乳糖激酶启动子（GAL1）,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,A、将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录,半乳糖诱导、葡萄糖抑制,Promoter,GAL10,3）pho4TS-PHO5启动子,A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子,C、pho4TS 温度敏感，35时失活，PHO5关闭,D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23）诱导表达,低温诱导、磷酸盐抑制,酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：性结合因子：MF-酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL,2、酿酒酵母分泌系统,*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用*信号肽结构：,酿酒酵母信号肽特点,正电荷区,疏水区,极性区,Met,目的蛋白,信号肽剪切位点,*分泌效率高*在酵母系统具有通用性*88个残基组成,MF-信号肽,Met,目的蛋白,-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-,KEX2,DAP,DAP,DAP：STE13编码的二肽酶,糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化,3、酿酒酵母糖基化系统,*过糖基化（超糖基化修饰）：N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。*糖链组成 O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团,酿酒酵母糖基化特点,1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2）分泌表达产物过糖基化,4、酿酒酵母表达系统的缺陷,（二）甲醇酵母表达系统,甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇酵母表达系统的应用,甲醇酵母表达系统操作原理,甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策,甲醇酵母表达系统的优缺点,1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇酵母（methylotrophic yeast)指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。毕赤酵母（Pichia pastoris)汉森酵母（Hansenula ploymorpha)假丝酵母（Candia boidinii),1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇氧化酶A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上 B、名称和拷贝数不同毕赤酵母/假丝酵母 汉森酵母 醇氧化酶 甲醇氧化酶alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOXAOX1、AOX2 MOX,1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,AOX1与AOX2*毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因 AOX1、AOX2*AOX1与AOX2基因97%同源*AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性,1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇氧化酶启动子A、目前已发现的、最强的真核启动子B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导,2、甲醇酵母表达系统的优缺点,A、表达水平高（最高水平的系统）B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150 个甘露糖）D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统）E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。F、实验室和工业操作简单G、不能满足结构要求严格的糖基化,3、甲醇酵母表达系统操作原理,宿主株与标记基因甲醇酵母系统的整合事件胞内表达与分泌表达,甲醇酵母系统宿主,二大宿主系统主要特点,项目 毕赤酵母 汉森酵母,最适温度 30 37最适pH值 4.5 4.5甘油阻遏 是 否糖基化 部分过度 较正常高密度发酵 100g/L 100g/L,甲醇酵母系统宿主,二大宿主系统主要选择标记,宿主 选择标记,毕赤酵母 his4、G418、Zeocin、Cu+汉森酵母 leu2、his3、ura3、G418,甲醇酵母系统宿主,毕赤酵母系统主要宿主株,宿主株 特点,Y11430 野生型、Mut+GS115 his4-、Mut+KM71 his4-、aox1:ARG4(AOX1-)、Muts SMD1168 his4-、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003 his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生长,甲醇酵母系统的整合事件,YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。YIp型载体：A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组B、有“插入”和“取代”二类整合模式C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合,毕赤酵母系统模式表达载体,1）AOX1位点插入,宿主株:GS115、KM71可插入位点：5AOX1 3AOX1 TT,转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts,2）His4位点插入,转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts,宿主株:GS115、KM71可插入位点：5His4 3His4,3）多基因插入事件（串联整合）,宿主株:GS115、KM71可插入位点：5AOX1 3AOX1 TT,转化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts,4）基因取代（GS115，AOX1+）,转化子：His4+Muts,汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体,高拷贝整合元件：A、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点B、缺陷型标记基因：Leu2d 提高选择压力C、抗性标记；neo 提高选择压力,甲醇酵母系统胞内表达载体,表达载体类型,需要带入ATG,单位点,甲醇酵母系统胞内表达载体,表达载体类型,需要带入ATG,多位点,甲醇酵母系统分泌表达载体,信号肽：PHO1,甲醇酵母系统分泌表达载体,信号肽：MF,甲醇酵母系统分泌表达载体,信号肽：MF,标记：Kan,4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策,载体稳定性基因剂量整合位点甲醇利用表型mRNA5端AT含量分泌信号表达产物稳定性,1）载体稳定性,同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高YRp型载体的稳定化：选择非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时，整合位点不确定。采用YIp型载体:更易实现整合、整合位点清楚,2）基因剂量,外源基因表达存在基因剂量效应筛选多拷贝整合子 载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子构建高拷贝整合型表达载体,3）整合位点,外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均可高效表达毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低,4）甲醇利用表型,在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达,5）mRNA5端,mRNA5端非翻译区（UTR）的组成与长度应尽量与AOX1/MOX的一致应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构,6）基因序列的AT含量 AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构,7）分泌信号,分泌表达效率与所用分泌信号高度相关可采用酿酒酵母来源的MF、PHO或SUC等的信号肽，或野生型信号肽，但适用性要比较分析。,8）表达产物稳定性 分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168,