《转录基本知识》PPT课件.ppt

第三章 转录基本知识 RNA的生物合成,RNA Biosynthesis,Transcription,遗传信息传递的 中心法则,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上。细胞分裂过程中，DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给子细胞。子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。一些RNA病毒能以自己的RNA为模板A为合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,RNA 生物 合成主要内容,一，RNA 基本性质 1，RNA 化学结构 2，RNA 分子结构 3，RNA 种类 及功能 二，转录的分子事件 1，转录概念 2，转录基本特点 3，转录发生过程（原核生物真核生物差异）：（1）转录的酶与蛋白因子（2）转录启动区域：启动子（3）转录的起始，延伸及结束 4，真核转录后加工三：RNA降解四：RNA转录应用,1，RNA 化学结构RNA/DNA Structure,RNA含有四种基本碱基，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外还有几十种稀有碱基。,2 RNA的分子结构,RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3，5磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那样都是双螺旋结构，只有在许多区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要46对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。构。,3,RNA 种类及功能,RNA按功能不同分为三类，即信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)及核蛋白体RNA(rRNA)。在大多数细胞中RNA的含量比DNA多58倍。,RNA理化特点,RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链，二是它的碱基组成与DNA的不同，RNA没有碱基T（胸腺嘧啶），而有碱基U（尿嘧啶）。所以导致他们有以下性质上的不同。1.两性解离：DNA无，只有酸解离，碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）。RNA有，有PI。2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA为线状分子，RNA为线团。3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解。4.显色反应：鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA-绿色化合物 DNA-蓝紫色化合物苔黑酚 二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的离心和电泳显色可用它们。,5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。6.紫外吸收：核酸的m260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。当A1时，DNA：50ug/ml，RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280还可来表示核酸的纯度。8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。,紫外分光光度计 A260/A280和A260/A230的含义,A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50蛋白质/DNA溶液A230nm，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A260/A280和A260/A230：是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm。纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。,在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录（transcription）。经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA(small nuclear RNA和HnRNA等。,二，转录的分子事件 1，转录概念,mRNA携带了DNA的遗传信息，在蛋白质合成中作为合成蛋白质的模板起传递遗传信息的作用。tRNA的二级结构最具特色，呈三叶草型。其主要功能部位有二个，一是氨基酸臂的 3末端为-CCA-OH，起特异结合氨基酸作用；二是有一个反密码环，环上有反密码子，与mRNA上的密码子反向互补，于是由tRNA携带的氨基酸可被转运到与密码子对应的部位，因此tRNA具有携带转运氨基酸的作用。tRNA的三级结构为倒“L”型，是天然状态下的构象。rRNA不单独存在，它与蛋白质结合为核蛋白体，分为大小亚基，存在于粗面内质网与胞浆中。核蛋白体是蛋白质生物合成的场所。snRNA 参与RNA 剪辑,复制和转录的区别,转录是基因表达的中心环节,转录是以 DNA为模板合成RNA,并且只是以单股DNA 为模板，因此具有不对称性；用以转录的单链DNA,称为模板链,与复制不同，转录是局部的,从启动子开始到终止子结束,为一个转录单位;转录不需要引物；转录的忠实性相对弱；转录首先得到RNA前体，然后再进行加工转变为成熟的RNA.,2，转录基本特点,Characters of RNA Biosynthesis,转录（transcription）的不对称性就是指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。,（1）、转录的不对称性,能够转录RNA的那条DNA链称为模板链(template strand)，也称作反义链。与模板链互补的另一条DNA链称为编码链(coding strand)，也称为有意义链。,模板链,编码链,编码链,模板链,模板链和编码链的相对性,模板链、编码链与转录及翻译的关系,RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。,（2）、转录的连续性,RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为35，而RNA链的合成方向为53。,（3）、转录的单向性,RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终止位点。特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成。,（4）、有特定的起始和终止位点,3，转录发生过程（1）参与转录合成的酶和蛋白因子,Enzymes and Protein Factors for RNA Biosynthesis,原料：NTP（ATP,UTP,GTP,CTP）。模板：单链DNA。酶：RNA聚合酶（RNA-pol）。其他蛋白质因子：如转录因子、终止因子等。,参与RNA转录合成的物质,这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP）。该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从53聚合形成RNA。,RNA聚合酶（DDRP）,原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即2。亚基与转录起始点的识别有关，在转录合成开始后被释放；余下的部分（2）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。,原核生物的RNA聚合酶,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶,原核生物RNA聚合酶亚基的功能,单因子RNA 聚合酶,T3,T7，sp6噬菌体RNA 聚合酶 200多个氨基酸组成的多肽 特异性多噬菌体上几个启动子进行转录。体外获得单链或者双链RNA的最好的工具！简单，高效。RNA 聚合酶+T7/T3/T6启动子+DNA 双联模板+终止子+NTP+Mg2+H2O,真核生物中的RNA聚合酶可按其对-鹅膏蕈碱的敏感性而分为三种，它们均由1012个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。,真核生物的RNA聚合酶,在真核生物中，转录的起始过程较为复杂，现已发现数百种蛋白因子与RNA转录合成有关。凡是与基因表达调控相关的蛋白因子统称为反式作用因子（transacting factor）。,转录因子,在反式作用因子中，直接或间接参与转录起始复合体的形成的蛋白因子被称为转录因子（transcriptional factor,TF）。不同的RNA聚合酶存在相应的转录因子，如与RNA聚合酶相关的转录因子包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TFH等。,真核生物RNA聚合酶转录因子及其功能,协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）则称为终止因子(termination factor)。有的终止信号的作用可被特异的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越过终止子继续转录，这称为通读(readthrough)，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子(antitermination)。原核生物中的终止因子蛋白是一种六聚体的蛋白质，亚基的分子量为50kd。蛋白能识别转录终止信号，并与RNA紧密结合，导致RNA的释放。,终止因子,三：RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promoter),终止子(terminator),转录起始需解决两个问题：必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,1 起始：RNA聚合酶识别起始区,在原核生物中，若干功能相关的结构基因常常串联在一起，由其上游的同一调控序列进行调控，这种基因的组织形式称为操纵子（operon）。,1.模板与酶的辨认识别：,DNA分子中参与转录调控的序列统称为顺式作用元件（cis-acting element）。原核生物转录起始时，首先由RNA聚合酶中的因子识别转录起始点，并促使核心酶结合形成全酶复合物。,位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA调控序列被称为启动子（promoter）。启动子序列通常由一些带共性的保守序列构成。,利用足迹法(footprint)和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。原理:DNA和蛋白质结合以后便不会被DNAase分解，在测序时便出现空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸对数目。在用酶移出与蛋白质结合的DNA后，又可测出被结合处DNA的序列。,足迹法确定启动子序列,原核生物启动子的保守序列,原核生物转录起始区的一致性序列,大肠杆菌启动子共有序列的功能,起点,被RNA聚合酶辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。RNA聚合酶与该区结合后，即滑动至-10区的TATAAT序列（Pribnow盒），并启动转录。,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,氢键 结合于大小沟解链区-9-+13,DNA局部双链解开。,RNA聚合酶全酶(2)与模板（启动子区）结合。,在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。产生第一个核苷酸(+1),RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,2.转录的起始过程：,Transcription Initiation,Complex:RNA polymerase makes many small,abortive transcripts without ever leaving the Promoter.the abortive transcripts up to 9-10 nt in size流产转录通过启动子（起始）快：强启动子 慢：弱启动子,转录起始可被抑制,利福平rifamycin：抑制亚基利迪链霉素strepolydigin抑制亚基 注意链霉素strepomycin结合了细菌核糖体 30S 小亚基放线菌素D actinomycin 抑制真核聚合酶I，与DNA 结合，阻止延伸（凋亡）-鹅膏蕈碱amanitin：具有双环结构的八肽毒素，真核聚合酶II 结合，抑制催化合成mRNA，（致死）,因子从全酶上脱离，余下的核心酶继续沿DNA链移动，按照碱基互补原则，不断聚合RNA。1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,（二）转录延长,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,转录空泡(transcription bubble)的形成,原核生物转录过程中的羽毛状现象,RNA转录合成的终止机制有两种：1，内在因子，非Rho因终止子：转录的终止的特殊信号（一段RNA 序列）2依赖Rho因子的转录终止：由终止因子（因子）识别特异的终止信号，并促使RNA的释放。,（三）转录终止：RNA 聚合酶停滞，RNA 解离,模板DNA链在接近转录终止点处存在相连的富含GC和AT的区域，使RNA转录产物形成寡聚U及发夹形的二级结构，引起RNA聚合酶变构及移动停止，导致RNA转录的终止。,1非依赖Rho的转录终止：,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,大肠杆菌两类终止子的回文结构,A.不依赖于Rho（）的终止子,A.依赖于Rho（）的终止子,富含G-C,系列U,ATP,2，依赖 Rho因子的转录终止,DNA 序列缺乏共性，不能形成强的发卡结构,6聚体，具有NTP酶和解螺旋酶,原核转录和翻译同时进行,mRNA 翻译起始：SD 序列:AUG上游的7-12 和核苷酸，AGGAGG与16S RNA互补 UCCUCC,真核生物的转录过程,1.转录起始的上游区段：UAS真核生物的转录起始点上游-35-25bp区也存在一段富含TA的顺序，被称为Hogness盒或TATA盒，通常认为是启动子的核心序列。,（一）转录起始：真核生物的启动子,除此之外，在真核生物中还可见到其他带共性的序列，如-80-70,CAAT盒(ccaat)及-110-80GC盒(gggcggg)等。TATA盒上游的序列：UAS,在远离受控基因处存在的，能够增强基因转录活性的调控序列称为增强子（enhancer）。增强子特点：p79 远距离效应；无方向性；顺势调控；广泛性，相位性,真核生物启动子保守序列,参与转录位点确定起始,控制转录起始频率,真核生物中的RNA聚合酶可按其对-鹅膏蕈碱的敏感性而分为三种，它们均由1012个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。,真核生物的三种RNA聚合酶,真核生物RNA聚合酶转录因子及其功能,真核转录起始需要各种转录因子,真核生物转录起始时，首先由TFD的TBP亚基识别并结合TATA盒，然后在其他转录因子的配合下，与RNA聚合酶组装形成转录起始前复合物(pre-initiation complex,PIC)。,2.转录起始过程：,RNA聚合酶催化第一个磷酸二酯键形成。RNA聚合酶的羧基末端结构域（CTD）被磷酸化修饰，大部分转录因子脱离，聚合酶向下游移动延伸RNA链。,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物类似，但由于存在核小体的高级结构，故在转录延长过程中可观察到核小体移位和解聚现象。,（三）转录终止,真核生物转录终止与转录后修饰，即poly A尾巴结构的添加密切相关。在poly A修饰位点的下游存在一组共同序列AATAAA和GTGTGT，为转录终止的识别修饰位点。在转录越过修饰点后，RNA链在修饰点处被切断，随即进行加帽和加尾修饰。,真核生物RNA的转录终止,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,4 真核生物的转录后修饰,Post-transcriptional Modification in Eukaryote,1加帽（adding cap）：即在mRNA的5-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即HnRNA即可进行加帽。加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。,1、真核生物mRNA的转录后加工,（一）首、尾的修饰,2加尾（adding tail）：这一过程也是细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去3-端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA结构与mRNA的半寿期有关。,The 3 ends of mRNAs are generated by cleavage and polyadenylation；The sequence AAUAAA is necessary for cleavage to generate a 3 end for polyadenylation.,（二）mRNA的剪接（splicing）,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,mRNA,DNA,1.断裂基因（splite gene）,编码区 A、B、C、D,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列（结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序）。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列（不能指导多肽链合成的非编码顺序）。,核内带有外显子和内含子编码序列的初级RNA转录产物称为杂化核RNA（hetero-nuclear RNA,hnRNA）。hnRNA经剪接加工除去内含子编码序列并将外显子编码序列连接起来才能形成成熟的mRNA。,2.hnRNA和snRNA：,snRNA为核内小RNA，富含尿嘧啶，故以U作分类和命名，如 U1、U2等。snRNA与核内蛋白质组装形成小核蛋白体（snRNP），参与hnRNA的剪接加工。,3.hnRNA的剪接过程：,snRNP与hnRNA结合成为剪接体。,剪接体结构调整，U2和U6形成催化中心，发生转酯反应。,pG-OH(ppG-OH,pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应,I 型内含子,II 型内含子,线粒体与叶绿体的rRNA 中 无需自由Gpp 使用自身2-OH 进行攻击:(有酶催化活性的RNA分子命名为Ribozyme)!,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,4.mRNA的编辑和修饰,RNA的编辑(RNA editing):某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变（如 单碱基突变）RNA的修饰（RNA modification）：有些RNA，特别是前体rRNA和tRNA可能有特异性的化学修饰。,RNA的编辑:mRNA编辑是在mRNA水平上信息发生改变(碱基取代、插入或缺失)的过程。,在哺乳动物细胞中，mRNA中有时会发生单个碱基的替换，导致它所编码的蛋白质序列发生改变。在锥虫线粒体中，当碱基有条理地增加或缺失时，在一些基因的转录物中会发生更大范围的变化。mRNA编辑机理：非剪切作用改变mRNA。,碱基取代,如哺乳动物载脂蛋白B mRNA的编辑：载脂蛋白B的mRNA含29个外显子，有4563个code，第2153号code是CAA，在肝中mRNA 编码4563AA的蛋白，小肠中存在的脱氢酶使C脱氢，将CAAUAA，小肠的mRNA中编辑产生UAA使翻译停止在2153code处。,Apo100,Apo48:形成CM:乳糜颗粒,碱基的插入或缺失和移码,移码：锥虫coxII(cytochromeoxidase,细胞色素氧化酶II)基因的mRNA相对于其DNA序列出现了读码框的偏移，通过插入4个U，才能产生正确的读码框。,插入或缺失：锥虫线粒体的细胞色素氧化酶III mRNA序列分析表明，许多U并非在DNA中编码（红色）或在RNA中被除掉（用T表示）。这些U的专一性插入信息是由向导RNA(guide RNA)提供的，向导RNA含有和正确编辑的RNA互补的一段序列。,尿嘧啶残基的添加或删除过程：首先RNA切断，添加或去除尿嘧啶，最后进行末端连接。该反应在向导RNA的指导下由一个酶复合体催化完成的。,二、tRNA的转录后加工,主要有以下几种加工方式：切断。剪接。3-末端-CCA序列添加。化学修饰。,tRNA前体,RNA pol,tRNA前体的转录合成,tRNA前体的切断和剪接加工,tRNA3-末端-CCA序列的添加,tRNA的碱基修饰,三、rRNA的转录后加工,真核生物中前体包括了18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA序列。在高等真核生物中，前体以沉降速率来命名，命名为45SRNA，在低等真核生物中，它比较小（如酵母中为35S）,rRNA前体的转录和剪接加工,原核生物中前体包括了16S rRNA、23S rRNA和5S rRNA和tRNA序列。前体为30S RNA。,RNA生物功能的多样性,1、RNA在遗传信息的翻译中起着决定作用。2、RNA具有重要的催化功能和其他持家功能。3、RNA转录后加工和修饰依赖于各类小RNA和其他蛋白质复合物。4、RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节作用。5、RNA在生物进化中起重要作用。,五、RNA的降解,RNA降解是涉及到基因表达的一个重要环节，rRNA和tRNA是稳定的RNA，其更新率低；mRNA是不稳定的RNA，其更新率非常高。因为mRNA于其编码基因的表达活性直接有关，不同的RNA需要以不同的速度进行降解。脊椎动物细胞mRNA的平均半衰期约为3h,细胞每一世代中各类mRNA约周转10次。细菌mRNA的半衰期大约只有1.5min，以适应快速生长和对环境作出快速反应的要求。所有细胞中都存在各种核糖核酸酶，可以降解RNA。真核生物mRNA降解的主要途径首先是poly(A)尾巴的缩短，去腺苷酸化能诱发脱去5端帽子结构，然后由5 3方向和3 5 方向降解mRNA。,细菌mRNA的降解总的方向为5 3；降解由两部分组成：核酸内切酶的切割，以及核酸外切酶对这些片段从3 5方向的降解。,mRNA稳定性的调控,真核生物能否长时间、及时地利用成熟的mRNA分子翻译出蛋白质以供生长发育的需要，与mRNA的稳定性以及屏蔽状态的解除相关的。原核生物mRNA的半衰期平均3min。高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均3h。在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定，有的寿命长达数天。,mRNA的3端尾巴通过影响mRNA寿命来影响翻译效率。,mRNA转录后降解的调节：mRNAs的3非翻译区（3-untranslated region，UTR）的富含AU的元件（AU-rich element，ARE），它会介导mRNA的快速衰减（ARE-mediated mRNA decay，AMD）。这是由基因序列决定的。,mRNA稳定性因素:mRNA两端的修饰防止它被外切酶降解；mRNA中的特异序列可影响它的稳定/非稳定性；poly(A)的缺失可能引发非稳定性。,核酸合成的抑制剂,核苷酸合成抑制剂,氨基酸类似物 叶酸类似物 碱基和核苷酸类似物,烷化剂放腺菌素嵌合剂,与DNA模板结合的抑制剂,作用于DNA聚合酶或RNA集合酶的抑制剂,抗菌素:如利福平、曲张霉素肽类化合物：-鹅膏蕈碱,DNA和RNA合成的比较,应用,1，抗生素：抑制转录2，基因工程：启动子，3，反义RNA 与mRNA 互补，阻断其表达。,原核,真核,