《转基因动物》PPT课件.ppt
转基因动物 2012年12月,主要内容,基本概念转基因动物的命名目前制作转基因动物的主要方法转基因动物研究的意义及应用,随着现代高新科学技术的发展，现代实验动物学已从过去注重于动物饲养管理和实验操作的宏观向微观方向发展。对小鼠基因组研究的目的不仅在于了解小鼠本身的基因结构，更主要的是为人类基因组研究、人类遗传疾病研究提供动物模型。,一、基本概念,转基因动物（Transgenic animal）:是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代严格说，转基因动物有别于嵌合体。基本原理:目的基因或基因组片段 受精卵或着床前胚胎细胞 受体动物的输卵管或子宫中 携带有外源基因的转基因动物,转基因动物技术发展的四个阶段,第一，实现外源基因的导入（随机整合）第二，实现导入的外源基因定点整合（同源重组，基因打靶技术）第三，实现导入的外源基因的组织特异性表达（借助于一系列组织特异性启动子的应用）第四，实现导入的外源基因的时间特异性表达（应用Cre/loxP重组酶系统）,二、命 名,1符号(1)一个转基因符号由以下三部分组成：TgX(YYYYYY)Zzz，TgX=方式；(YYYYYY)=插入片段标示；=实验室指定序号；Zzz=实验室注册代号；,(2)方式TgX 转基因符号通常冠以Tg字头。随后的一个字母X，表示DNA插入的方式：H 代表同源重组；R 代表经过逆转录病毒载体感染的插入；N 代表非同源插入。,（3）插入片段标示(YYYYYY)是由研究者确定的表明插入基因显著特征的符号。通常由放在圆括号内的字符组成：可以是字母（大写或小写），也可由字母与数字组合而成，不用斜体字，上下标、空格及标点等符号。,应注意以下几点：1）标示应简短，一般不超过六个字符。2）如果插入序列源于已经命名的基因，应尽量在插入标示中使用基因的标准命名或缩写，但基因符号中的连字符应省去。3）插入片段标示只表示插入的序列，并不表明其插入的位置或表型。,一些标示的标准命名缩写：An 匿名序列；Ge 基因组；Im 插入突变；Nc 非编码序列；Rp 报告基因；Sn 合成序列；Et 增强子捕获装置；Pt 启动子捕获装置。,（4）实验室指定序号及实验室注册代号实验室指定序号：是由实验室对已成功的转基因系给予的特定编号，最多不超过5位数字。而且，插入片段标示的字符与实验室指定序号的数字位数之和不能超过11。实验室注册代号：是对从事转基因动物研究生产的实验室给予的特定符号。,2.举例 C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23 Jwg：来源于美国杰克逊实验室（J）的C57BL/6品系小鼠被转入人的CD8基因组（Ge）；转基因在Jon W.Gordon(Jwg)实验室完成，获取于一系列显微注射后得到的序号为23的小鼠。转基因符号缩写:C57BL6J-TgN23Jwg,TgN(GPDHIm)1Bir以人的甘油磷酸脱氢酶基因（GPDH）插入（C57BL/6J X SJL/J）F1代雌鼠的受精卵中，并引起插入突变（Im），这是Edward H.Birkenmeier(Bir)实验室命名的第一只转基因小鼠。根据转基因动物命名原则，如果转基因动物的遗传背景由不同近交系或远交群混合而成时，该转基因符号不使用动物品系或种群的名称。缩写：TgN1Bir,三、遗传修饰动物模型的建立方法,1、转基因技术：目的基因 整合 受精卵（或胚胎干细胞）导入 受体子宫 发育成含目的基因的个体，此个体能把目的基因遗传下去。2、核移植技术:又称动物整体克隆技术。将一个体细胞的核导入另一个体的去核卵细胞中，使之发育成个体。3、基因剔除技术：又称基因靶向灭活。指有目的地去除动物体内某种基因的技术。基本原理是同源重组技术。,导入基因的主要方式,显微注射法ES细胞法电穿孔脂质体逆转录病毒感染法精子载体导入法等,（一）雄原核显微注射法,以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。,一、设计转基因构件 1、目的基因的获取 2、基因载体（复制子）的选择与构建 3、目的基因与载体的连接（连接酶）：重组DNA 分子二、动物操作 1、准备假孕母鼠（养母）2、受精卵的准备 3、基因导入 4、胚胎移植 5、对幼鼠的鉴定,转基因工作需要的动物,1、需要的野生型小鼠类型包括：幼龄雌鼠（21-28天）用作胚胎供体；成年雄鼠；成年雌鼠，作为胚胎移植的受体；输精管结扎的雄鼠，用来产生假孕雌鼠；青年野生型雄鼠和雌鼠，与转基因鼠交配，建立转基因品系。2、从胚胎移植到成年小鼠总计约11周的时间胚胎移植约19天 幼鼠约21天 断乳小鼠约4-5周 成年小鼠约19天 幼鼠。,原核注射法制备转基因鼠技术路线,优点：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观；整合率高缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默,（二）胚胎干细胞（ES细胞）法,ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。在ES细胞上的基因操作：可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。,优点：外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体,（三）完全基因剔除转基因动物,完全基因剔除(entirely knock-out)：又称基因敲除、基因打靶，指应用一段与胚胎干细胞染色体上的一段序列具有高度同源性的灭活外源DNA，通过同源重组取代原有目的基因，使靶基因在动物个体中的活性完全消除，来观察靶基因失活、不表达的情况下会对动物个体产生哪些影响。基本原理：灭活基因 电穿孔 体外ES细胞 同源重组，筛选 基因定点灭活的细胞 显微注射 小鼠囊胚 胚胎移植 假孕鼠子宫内 发育 嵌合体小鼠 选择培育 基因剔除小鼠,基因剔除的技术路线,转基因动物技术使动物和人体基因工程研究从以往的单基因离体水平的操作，发展到了离体和在体相配合的、分子和细胞水平操作的，有动物整体水平产生效应的崭新阶段，它使得人们能从更完整的系统中去认识生物分子的作用，应用前景广阔。,转基因动物研究的意义和作用：1、生命现象的基础研究。转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，如研究基因的结构与功能的关系，细胞发育的潜能性、细胞核与细胞质的相互关系、胚胎发育调控、肿瘤、神经与发育等。2、可以用来建立多种动物模型，进而研究这些疾病的发病机理、治疗方法及新药的筛选。,3、可作为医用或食用蛋白的生物反应器。通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白，一直是转基因动物研究的热点。现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达，这些蛋白可以用于治疗人类相关疾病。4、利用基因敲除技术提供廉价的异种移植器官。只要将引起强烈免疫排斥反应的异源分子基因敲除掉就可以。例如培育不含免疫排斥的转基因克隆猪。,5、改良和培育动物新品种。如使生长速度加快，瘦肉率提高、肉质改善、饲料利用率提高、抗病力增强等6、基因治疗。人类第一例于1990年对SCID综合症的小孩实施体细胞基因治疗获得成功。,转基因动物的饲养管理,、避免混淆。在转移小鼠笼时，务必将鼠笼标记信息和笼内小鼠一起转移。、转入病毒全基因组的动物，病毒可能在体内复制，可能与接种病毒的小鼠有类似的逸散、传播方式和感染途径。3、逃逸。造成遗传污染，改变自然界的生态平衡、改变生物的多样性和破坏生态环境。防逃逸设施至关重要,谢 谢！,
