《质谱分析丛》PPT课件.ppt

有机波谱分析（四）,质谱分析法,一、质谱的发展历史,1906年 J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比(m/z)有关,并于1912年制造出第一台质谱仪.1946年 发明飞行时间质量分析器(Time-of-flight Analyzer)1953-1958年 出现四极杆质量分析器(Quadrupole)1956年 GC-MS开始联用 1959年 质谱首次用于peptide sequencing 1965年 离子共振质谱出现 1968年 电喷雾离子源Electrospray Ionization 1973年 LC-MS 1974年 Fourier transform ion cyclotor resonance MS 1987-1988年 Matrise_assisted laser desorption ionization 1996年 电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究,质谱仪：是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子、测定分子量进行成分和结构分析.离子的生成方式：有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化),二、质谱仪,2-1 质谱仪的组成,离子源,质量过滤/分析器,检测器,进样部分样品板LC或GC,EI源FAB源MALDI源ESI源,QuadruopoleIon trapTime-of-flight,电子倍增器闪烁计数器,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,主要组成部分:1.进样部分；2.离子源；3.质量过滤器(分析器)；4.离子检测器,2-2 进样部分,要求：大气压下的样品要进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。方式：进样板进样 进样头进样 毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱）,2-3 离子源,A:EI源 Electron Ionization 是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测,样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小于6ev)形成离子及部分碎片.,EI的优缺点,优点1.高的灵敏度2.有达10万个化合物的数据库可快速检索3.可根据碎片方式鉴定未知物4.从碎片离子判定结构,缺点1.质量范围小2.有可能汽化前发生解离3.碎片过多有时看不到分子离子,B:FBI快速原子/离子轰击离子源Fast Atom/Ion Bombardment,使用高能量的氙原子、Cs+离子或甘油-NH4+基团喷射样品靶上的样品和基质表面,基质是溶解样品的非挥发性溶剂,样品从基质中解吸附并汽化,离子化.基质的作用是溶解样品;吸收大部分能量,有助于样品离子化并保护样品不被高能量撞击破坏.,图示,FBI优缺点,优点1、质量数可以做到7000Da。2、快速。3、软电离方式，碎片离子少。4、容易引入阳离子形成M+Na,M+K型的正离子。5、分辨率高。基质可作为参照离子进行精确质量测定。6、大质量的甘油团形成多电荷可测生物大分子。,缺点1、质量数高时灵敏度下降严重。2、灵敏度比MALDI,ESI低。3、碎片少，结构信息少。4、基质多峰，干扰结果分析。5、样品必须能溶于基质。6、非极性物质难以离子化。,C:MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization,MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。1、使用基质，但基质为固体。2、MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。,常用基质,1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白3、龙胆酸（2,5二羟基苯甲酸 DHB 聚合物4、吡啶甲酸 PA5、3羟基吡啶甲酸 3HPAMALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析,常用基质结构,DHB,SA,CCA,MALDI的优缺点,优点1、质量数可达300,000Da。2、attomole 至femtomole级灵敏度。3、软电离方式，无或极少碎片离子。4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。5、适于分析复杂混合物。,缺点1、分辨率低。2、1000Da以下基质峰干扰。3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。5、不能分析非共价键相互作用。6、定量时需要内校准。7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。8、对各种赋形剂的容忍度低（如含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。,D:ESI离子源Electrospray Ionization,4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱入口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发，液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。一般分析物分子量 2000Da带多电荷,NANO-ESI喷雾照片,ESI特点,1、ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。,电荷数和质量数的计算,已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj=nk+1 推算出 nj=(mk-1)/(mk-mj)nk=(mj-1)/(mk-mj)m=mjnj-nj=mknk-nk,m/z,相对丰度,mj,mk,ESI优缺点,优点1、质量数可达70，000Da2、灵敏度高达femtomole级。3、软电离，可观察生物分子非共价反应。4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。5、没有基质干扰。6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。7、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。8、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。9、特别适于测多肽的修饰。10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。,缺点1、耐盐能力低。2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。3、样品需先气化，混合物不适用。4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。5、定量时需内校准。,E:其他离子化方式,阳离子化:以非共价键结合的方式向中性分子加上正电荷。尤其适合质子化不稳定的的分子，质子化是共价键结合，电荷从质子向分子发生转移，这一过程会造成分子的不稳定，使分子裂解。阳离子化没有这一缺点，常用在ESI离子方式中，糖类非常适合这一电离方式，一般多加Na+.阴离子化:分子失去一个质子，带上负电荷，这种离子化方式适合酸性物质，如酚类、羧酸和磺酸。,2-3 质量分析器（过滤器）,1、质量分析器的主要指标A、质量范围（/）所能测量的质荷比范围 M+nH B、灵敏度 一定浓度样品产生响应时，最低的浓度值。,n,C、分辨率 质谱分辨不同质荷比离子的能力 分辨率R=M/a=M/(M M)b a 公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比 b公式定义为相邻的相交10的两个峰M M 按a 式计算的分辨率约为b式计算的两倍。,不同分辨率谱图效果,D：分子量的表述方式,1、单同位素质量monoisotopic mass 最轻的稳定同位素的质量（也有说自然界中丰度最大的同位素的质量）。只有高分辨率的质量分析器才能分离出单同位素峰。2、化学平均分子量M 根据同位素质量及丰度计算出平均质量，所有元素的平均质量给出分子的平均质量。3、最高峰质量 即未分辨开质谱峰最高处的质量数。表述方式要看分子量及分辨率而定，当m/z高时单同位素峰已不是丰度最大的峰，m/z 8000时与最高峰质量趋于一至。,2、质量分析器的种类,A、四极杆质量分析器Quadrupole Analyzer A、B极性相反，加上一个直流电压DC，叠加一个射频电场RF，扫描时固定RF频率，DC：RF保持比率不变，数值递增，使m/z小到大的离子依次通过，取得一张完整的质谱图。,DC+RF,四极杆质量分析器的 优点,四极杆质量分析器通常与EI、ESI源联接1、能容忍相对低的真空度（约10 x10Torr）2、m/z可达3000，ESI离子源产生的多电荷生物分子离子m/z正好多在3000以内。3、开销低廉。,B、离子阱质量分析器,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,环形电极,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,C、飞行时间质量分析器 Time-of-Flight Analyzer,离子的E=UZ=mv 飞行时间t=,t=const,L,v,m,z,反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS),Uref,TOF对真空度的要求非常高10TorrMALDI源一般同时联接Time-of-Flight Analyzer和RETOF,D、傅立叶回旋共振质量分析器fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance,质量精度最高，达0.001,几种质量分析器的比较,质量分析器的串联,目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析 Collision-induced dissociation(CID)Ion source ion daughter ion granddaughter ion,选择离子,MS,CID,MS/MS,CID,MS/MS/MS,空间串联质谱仪,A、串联四极杆（三级四极杆）triple-Quadrupole AnalyzerQ为过滤单元Q为碰撞单元Q为分析单元,几种检测方式,1、MS方式：所有离子通过QQQ到达检测器。2、MS/MS方式：Q作为分析器选择母离子(前体离子），Q作为碰撞室产生子离子，子离子由Q分析。3、MS方式：,三级四极杆的几种扫描模式,1、子离子扫描模式：即MS/MS。2、前体离子扫描模式：Q依次将所有离子输入Q碰撞解离，Q设定一个特定子离子值，只检测此特定子离子，Q与Q联接，当检测器检测到子离子时，质谱仪记录的是Q中的子离子值，质谱图显示的是所有产生相同子离子的母离子。3、中性丢失扫描：Q扫描与Q有一特定质量差异的子离子，谱图显示的是所有特定中性分子丢失的母离子。,B、三级四极杆飞行时间质谱仪Quadrupole time of flight,C、飞行时间飞行时间质谱仪Time-of-flight/time-of-flight,时间串联质谱仪,A、离子阱质谱仪：,B、傅立叶回旋共振质谱仪Fourier transform-ion cyclotron resonance,离子进入共振腔后，通过调控RF，选择特定的母离子留在腔内，再引入惰性碰撞气体碰撞,产生碎片,并检测碎片离子，这一过程不断重复至MS。,几种串联质谱优缺点对比,2-4 检测器,1、电子倍增检测器：真空度低，表面易污染，寿命一般12年。,2、光电转换倍增器（闪烁计数器）,电子发射撞击荧光屏，荧光屏发射光子由光子放大器检测。光子放大器密封在容器中，光子可穿过密封玻璃，避免表面污染，寿命为5年。,3、HED(High-Energy Dynode Detector)在离子倍增器前加一个加速静电场，离子加速 后产生更多的二级电子引发电子雪崩，灵敏度更高。4、FT-MSFT-MS本身就是一个检测器，因为离子诱导产生的可检测电流与m/z有关,色谱-四极杆质谱仪结构示意图,三、质谱图,丙酮的质谱。图中的竖线称为质谱峰，不同的质谱峰代表有不同质荷比的离子，峰的高低表示产生该峰的离子数量的多少。质谱图的质荷比（m/z）为横坐标，以离子峰的相对丰度为纵坐标。图中最高的峰称为基峰。基峰的相对丰度常定为100%，其它离子峰的强度按基峰的百分比表示。在文献中，质谱数据也可以用列表的方法表示,丙酮的质谱,3-1 离子主要类型,1、分子离子（1）分子离子形成 样品分子失去一个电子而形成的离子称为分子离子。所产生的峰称为分子离子峰或称母峰，一般用符号 表示。其中“+”代表正离子，“”代表不成对电子。如：,分子离子峰的m/z就是该分子的分子量。,（2）形成分子离子时电子失去的难易程度及表示方法 有机化合物中原子的价电子一般可以形成键、键，还可以是未成键电子n（即独对电子），这些类型的电子在电子流的撞击下失去的难易程度是不同的。一般来说，含有杂原子的有机分子，其杂原子的未成键电子最易失去；其次键；再次是碳-碳相连的键；而后是碳-氢相连的键。即失去电子的难易顺序为：杂原子C=CCCCH 易 难,（3）分子离子峰的强度与结构的关系 分子离子峰的强度与结构的关系有如下规律：a 碳链越长，分子离子峰越弱；b 存在支链有利于分子离子裂解，故分子离子峰很弱；c 饱和醇类及胺类化合物的分子离子弱；d 有共振系统的分子离子稳定，分子离子峰强；e 环状分子一般有较强的分子离子峰,综合上述规律，有机化合物在质谱中的分子离子的稳定性（即分子离子峰的强度）有如下顺序：芳香环共轭烯烯环状化合物羰基化合物醚酯胺酸醇高度分支的烃类。,（4）分子离子峰的识别方法（i）注意m/z值的奇偶规律 只有C.H.O组成的有机化合物，其分子离子峰的m/z一定是偶数。在含氮的有机化合物（N的化合价为奇数）中，N原子个数为奇数时，其分子离子峰m/z一定是奇数；N原子个数为偶数时，则分子离子峰m/z一定是偶数。（ii）同位素峰对确定分子离子峰的贡献 利用某些元素的同位素峰的特点（在自然界中的含量），来确定含有这些原子的分子离子峰。（iii）注意该峰与其它碎片离子峰之间的质量差是否有意义 通常在分子离子峰的左侧314个质量单位处，不应有其他碎片离子峰出现。如有其它峰（出现），则该峰不是分子离子峰。因为不可能从分子离子上失去相当于314个质量单位的结构碎片。,2、碎片离子,碎片离子是由于分子离子进一步裂解产生的。生成的碎片离子可能再次裂解，生成质量更小的碎片离子，另外在裂解的同时也可能发生重排，所以在化合物的质谱中，常看到许多碎片离子峰。碎片离子的形成与分子结构有着密切的关系，一般可根据反应中形成的几种主要碎片离子，推测原来化合物的结构,3、亚稳离子,质谱中的离子峰，不论强弱，绝大多数都是尖锐的，但也存在少量较宽（一般要跨25个质量单位），强度较低，且m/z不是整数值的离子峰，这类峰称为亚稳离子（metastable ion）峰。（1）亚稳离子的产生 正常的裂解都是在电离室中进行的，如质量为m1的母离子在电离室中裂解：m1+m2+中性碎片,生成的碎片离子就会在质荷比为m2的地方被检测出来。但如上述的裂解是在m1+离开了加速电场，进入磁场时才发生，则生成的碎片离子的能量要小于正常的m2+。因它在加速电场中是以m1的质量被加速，而在磁场中是以m2的质量被偏转，故它将不在m2处被检出，而是出现在质荷比小于m2的地方，这就是产生亚稳离子的原因。一般亚稳离子用m*来表示。m1、m2、和m*之间存在下列关系：m*=m22/m1,（2）亚稳离子的识别a 一般的碎片离子峰都很尖锐，但亚稳离子峰钝而小；b 亚稳离子峰一般要跨25个质量单位；c 亚稳离子的质荷比一般都不是整数。,（3）亚稳离子峰在解析质谱中的意义 亚稳离子峰的出现，可以确定 m1+m2+的开裂过程的存在。但须注意，并不是所有的开裂都会产生亚稳离子。所以，没有亚稳离子峰的出现并不能否定某种开裂过程的存在,4、同位素离子,质谱中还常有同位素离子（istopic ion）。在一般有机化合物分子鉴定时，可以通过同位素的统计分布来确定其元素组成，分子离子的同位素离子峰相对强度比总是符合统计规律的。如在CH3CI、C2H5CI等分子中CIm+2/CIm=32.5%，而在含有一个溴原子的化合物中(M+2)+峰的相对强度几乎与m+峰的相等。同位素离子峰可用来确定分子离子峰。,5、重排离子,重排离子是由原子迁移产生重排反应而形成的离子。重排反应中，发生变化的化学键至少有两个或更多。重排反应可导致原化合物碳架的改变，并产生原化合物中并不存在的结构单元离子。,3-2 质谱解析及应用,1、质谱解析 解析未知物的图谱，可按下述程序进行。第一步 对分子离子区进行解析（推断分子式）（1）确认分子离子峰，并注意分子离子峰对基峰的相对强度比，这对判断分子离子的稳定性以及确定结构是有一定帮助的。（2）注意是偶数还是奇数，如果为奇数，而元素分析又证明含有氮时，则分子中一定含有奇数个氮原子。（3）注意同位素峰中M+1/M及M+2/M数值的大小，据此可以判断分子中是否含有S、CI、Br，并可初步推断分子式。（4）根据高分辨质谱测得的分子离子的m/z值，推定分子式。,第二步 对碎片离子区的解析（推断碎片结构）（1）找出主要碎片离子峰。并根据碎片离子的质荷比，确定碎片离子的组成。常见碎片离子的组成见表,离子 失去的碎片 可能存在的结构M-1 H 醛，某些醚及胺M-15 CH3 甲基M-18 H2O 醇类，包括糖类M-28 C2H4，CO，N2C2H4，麦氏重排，COM-29 CHO，C2H5 醛类，乙基M-34 H2S 硫醇M-35 CI M-36 HCI 氯化物M-43 CH3CO，C3H7 甲基酮，丙基M-45 C00H 羧酸类M-60 CH3COOH 醋酸酯,（2）注意分子离子有何重要碎片脱去,m/e 离子 可能的结构类型29 CHO、C2H5 醛类、乙基30 CH2NH2 伯胺43 CH3CO CH3CO C3H7 丙基29、43、57、71 等 C2H5、C3H7 直链烷烃39、50、71 芳香化合物 芳香化合物52、65、7760 CH3COOH 羧酸类、醋酸类91 C6H5CH2 苄基105 C6H5CO 苯甲酰基,（3）找出亚稳离子峰，利用m*=m22/m1，确定m1与m2的关系，确定开裂类型。第三步 提出结构式 根据以上分析，列出可能存在的结构单元及剩余碎片，根据可能的方式进行连接，组成可能的结构式,例 1 某未知物经测定是只含C、H、O的有机化合物，红外光谱显示在3 1003 600 cm1之间无吸收，其质谱如图，试推测其结构。,图 未知物质谱图,解：第一步 解析分子离子区（1）分子离子峰较强，说明该样品分子离子结构稳定，可能具有苯环或共轭系统。分子量为136。（2）根据M+1/M=9%，可知该样品约含8个C原子，查贝农表（一般专著中都有此表），含C、H、O的只有下列四个式子：（a）C9H12O(=4)（b）C8H8O2（=5）（c）C7H4O3（=6）（d）C5H12O4（=0）,第二步 解析碎片离子区（1）质荷比105为基峰，提示该离子为苯甲酰基（C6H5CO），质荷比39、51、77等峰为芳香环的特征峰，进一步肯定了苯环的存在。（2）分子离子峰与基峰的质量差为31，提示脱去的可能是CH2OH或CH3O，其裂解类型可能是简单开裂。（3）质荷比33.8的亚稳离子峰表明有m/z77 m/z51的开裂，56.5的亚稳离子峰表明有 m/z105 m/z77的开裂，开裂过程可表示为：CO C2H2 C6H5CO+C6H5+C4H3+m/z105 m/z77 m/z51,第三步 提出结构式（1）根据以上解析推测，样品的结构单元有（2）上述结构单元的确定，可排除分子式中的C9H12O(=4)、C7H4O3（H原子不足）、C5H12O4（=0），所以唯一可能的分子式为C8H8O2。由此可算出剩余碎片为CH3O，可能剩余的结构为CH2OH或CH3O。,（3）连接部分结构单元和剩余结构，可得下列两种可能的结构式：a b（4）由于该样品的红外光谱在3 1003 600cm1处无吸收，提示结构中无OH，所以该未知化合物的结构为（a）。,思考题与习题,1 有一化合物其分子离子的m/z分别为120，其碎片离子的m/z为105，问其亚稳离子的m/z是多少？,2 某有机化合物（M=140）其质谱图中有m/z分别为83和57的离子峰，试问下述哪种结构式与上述质谱数据相符合。a b,3 某一未知物的质谱图如图所示，m/z为93，95的谱线强度接近，m/z为79，81峰也类似，而m/z为49，51 的峰强度之比为31。试推测其结构。,图6.12 某未知物质谱图,4 某一液体的化学式为C5H12O，bp 138，质谱数据如图所示，试推测其结构。,图 化合物C5H12O的质谱图,5,6,7,8,9,10,11,