《血清蛋白质测定》PPT课件.ppt

第八章 体液蛋白质检验,人类白蛋白分子,本章内容概要：,第二节 体液蛋白质测定,第一节 概述,第一节 概 述,机体蛋白质：,体液蛋白质的检测：,机体主要的 生物大分子,含量：人体固体成分的45%,种类：10万，30005000种/单细胞,功能：生长，代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等,疾病发生,体液蛋白质异常,一、血浆蛋白质的功能和分类蛋白质（protein)：是人体内含量和种类最多的物质。有10万多种。血浆蛋白质（plasma protein):血浆中含量最多的成分。有1000多种。目前已研究的不下500种，其中已分离出纯品的有200多种。,（一）蛋白质概述：研究进展领域：生物化学家：分离纯化各种组分。研究其物理性质、氨基酸的组成及其顺序，以及某些蛋白质中结合的 糖、脂类、金属化合物、活性多肽、类固醇激素等，研究其合成、降解、转换更新与代谢调节的研究。生理学家与病理生理学家；注重蛋白质的生理功能，研究其胶体性质、缓冲性质和生理作用，运输、结合功能等。,血浆蛋白质 具有遗传的变异：如Hp、TFP等在不同的人群中常见有结构上的差异，以及某些蛋白质的缺乏表现出一定的临床症状，具有临床意义；遗传学家利用蛋白质结构上的差异作为研究人群与家族遗传特征的标志。临床生化检验中，微量蛋白质的检测及其技术的进展，用于诊断各种恶性肿瘤或各种病理变化过程等。在进化与个体发育的生物化学研究中，已发现有不少正常胎儿时期的蛋白质可以在恶性肿瘤病人中重新出现，如甲胎蛋白。血浆蛋白质合成的调控，如APR的表达与释放，在临床医学中长期受注意而又未完全解决的课题，它与限制炎症过程密切相关。,血浆蛋白质广泛应用于组织和细胞的培养，血浆中含有各总细胞刺激因子和抑制因子，它们对稀薄啊的活力、增殖、分化、胞内酶的合成及细胞特殊功能起者特殊的作用。在人类不少疾病，包括两种常见的疾病动脉粥样硬化及肿瘤的发病学研究，以及最常见的糖尿病及其并发症的发病机制中，血浆蛋白质均有广泛涉及。,（二）血浆蛋白质的分类 1.电泳分类法 2.功能分类法,1、电泳法：（醋纤膜电泳）正常人血清的区带电泳结果和扫描图像从左至右的5个区带依次为白蛋白及1、2、和球蛋白区。有时在慢电泳时球蛋白可分为1球蛋白和2球蛋白。白蛋白区的成分包括白蛋白、前白蛋白和部分1脂蛋白;1区包括1抗胰酶蛋白、1脂蛋白、c球蛋白;2区包括触珠蛋白、铜蓝蛋白、2巨球蛋白等;1区包括转铁蛋白、补体3、C4等;2区包括3、2微球蛋白、Fb;区包括IgA、Ig、Ig、CRP等。,正常血清蛋白电泳（serum protein electrophoresis,SPE)正常参考值：Alb:57%-68%1:1.0%-5.7%2:4.9%-11.2%:7%-13%:9.8%-18.2%,2.功能分类法 运输载体类 补体蛋白类 血清酶类血浆蛋白质 蛋白酶抑制物 免疫球蛋白 凝血蛋白类 蛋白类激素,运输载体类:血浆脂蛋白 前清蛋白和清蛋白 甲状腺素结合球蛋白 皮质素结合球蛋白视黄醇结合蛋白转铁蛋白 结合珠蛋白 血色素结合蛋白 铜蓝蛋白,补体蛋白类补体蛋白C B因子 D因子 备解素,P因子又称备解素（properdin），是替代途径中除C3以外最先发现的一种血浆蛋白。现已探明，P因子以聚合体形式而存在：即三聚体（54%）、二聚体（26%）和四聚体（20%）都有，但特异活性的顺序依次为：四聚体三聚体二聚体。P因子为由4条相同的肽链（分子量各55kDa）组成的四聚体分子，链间以非共价键相连接，分子量为220kDa。P因子的生物学活性是以高亲和力与c 3bBb和C 3bnBb相结合，结合后通过发生构象改变而加固C3b与Bb间的结合力，从而可使其半衰期由2分钟延长至26分钟。另外，P因子还可封闭H因子的抑制作用，更增加了上述两种酶的稳定性及活性，有利于促进替代途径级联反应的继续进行。因此，P因子实际上是替代途径中的一个重要的正调节分子。因其常成为c 3bBb和C3bnBb复合物中的组成成分之一，故将其作为补体系统的固有成分在此一并描述。此外，在膜增生性肾小球肾炎病人血清中发现有一种C3肾炎因子（C3nephritic factor,C3NeF）实际为C 3bBb的自身抗体，也可与C3bBb结合而增加c 3bnBb的稳定性，使其半衰期处长10-30倍。,凝血蛋白类:14个凝血因子中的13个均为蛋白质。免疫球蛋白:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,蛋白酶抑制物A1-抗胰蛋白酶（a1-AT）A1-抗糜蛋白酶（a1-ACT)A2-巨球蛋白（a2-MG),血清酶类:血浆固有酶LCAT、脂蛋白酯酶、凝血酶原、纤溶酶等蛋白类激素胰岛素、胰高血糖素、生长素等,3、血浆蛋白质的功能：营养：其中的氨基酸缓冲与胶体渗透压：维持血液渗透压运输：类固醇、甲状腺激素、维生素A、D、脂类、金属、微量元素、药物等；免疫与防疫功能：免疫球蛋白、补体凝血与纤溶酶的特殊功能代谢调控,（三）影响血浆蛋白质浓度的因素1、关于血浆蛋白质的正常参考值A、年龄组的差异AFP、AGM、a1AT浓度在新生儿期显著高于成人；AlbFibIgG与成人接近。其他成分特别是IgMIgA及C3、C4补体成分均偏低。对895岁的年龄组分布调查有以下几个特征Alb在50岁以前保持恒定，50岁以后有下降趋势；AA天灾男30岁、女40后有上升趋势；a1脂蛋白、AAT40后有上升趋势；Hp随年龄增加而增加；AGM在40岁以前随年龄增加而下降，到年老时 由有上升。,B、关于性别差异男性成人略高于女性的有：Alb、AAT、IgA等女性略高于男性成人的有：CER、AGM、a1脂蛋白等；在妊娠期明显增高的有：CER、TRF等。C、个体不同时期的差异及个体间的差异,五种血浆蛋白在个体内与人群间的差异 血浆蛋白 个体内不同时间的变异（CV%）不同个体间的变异（CV%）结合珠蛋白 9.5 71 1-酸性糖蛋白 11 42 转铁蛋白 2.5 9 1-抗胰蛋白酶 3 16 2-巨球蛋白 3 17,2、急性时相反应蛋白（acute phase reactants,APR)概念：在炎症、创伤、心肌梗塞、感染、肿瘤等情况下血浆中浓度显著上升或降低的蛋白质。升高的有：AAT、AAG、CER、C3、C4、CRP、Flb、hP等降低的有：PA、Alb及TRF，称为负性APR。,3、类固醇激素,二、血清蛋白质电泳组分的临床分析,1、正常血清蛋白电泳（serum protein electrophoresis,SPE)正常参考值：Alb:57%-68%1:1.0%-5.7%2:4.9%-11.2%:7%-13%:9.8%-18.2%,方法：琼脂凝胶电泳染料：氨基黑,正常血清蛋白电泳图,2、异常血清蛋白电泳（1）双白蛋白血症型：主要特征：在白蛋白部位有两个区带，光密度计扫描出现双峰，呈剪刀状。产生原因：双白蛋白血症分为持久型和暂时型两种。持久型主 要是一种家族性血清蛋白异常的疾病，极少见，为 常染色体不完全显性遗传；而暂时型主要是指肾功 能不全的患者在治疗期间使用大剂量的-内酰胺类 抗生素，可形成快泳动性的白蛋白成分，治疗中断 即逐渐消失。,（2）先天性白蛋白缺陷型：主要特征：由于血清白蛋白的显著降低，血清总蛋白也随之降 低，1、2球蛋白明显增高，球蛋白也增高。严 重无白蛋白血症时，白蛋白有时可降为零。产生原因：本病是极少见的先天性疾病，可能由于肝细胞内白 蛋白合成功能遗传性缺陷或明显低下所致。该病患 者的白蛋白含量尽管只有正常人的0.05%，而其血 浆胶渗透压仍为正常人水平的 1/2左右，这是由于球蛋白代偿性增加所致，如传铁蛋白为正常人的 2-3倍，1巨球蛋白为正常人的3.5倍，脂蛋白为3 倍，IgM为3倍，这时血清白蛋白的半衰期也明显延长，可为正常人的3-4倍，对维持血浆胶体渗透压 均有一定作用。,（3）低白蛋白血症型：主要特征：血清总蛋白浓度明显减低，其中以白蛋白减低为主。产生原因：由于合成蛋白质所需的氨基酸长期供应不足，以致 血清中的主要成分白蛋白合成减少。常见于慢性营 养失调、肝硬化、肝炎、肾炎、肾病综合症、大面 积烧伤或内分泌紊乱、垂体病等。,检查结果：Alb 44.2%()；1 4.6%(N)；2 14.6%()18.3%()；18.3%(N)；慢性肾炎患者。,（4）1球蛋白缺陷型：主要特征：1球蛋白明显降低，有时可接近零，血清总蛋白及 其它各组分的蛋白通常没有明显变化。产生原因：此病通常认为是先天性或家族性的，系由于1抗胰 蛋白酶合成低下所致。因为血中1抗胰蛋白酶减少 或缺乏，致使血中或组织中的胰蛋白酶活性相对增 加，肺结缔组织破坏亢进，对青年可以发生肺气肿，当合并感染时，可见白蛋白减低，但由于1抗胰 蛋白酶减少，即使有炎性病灶，1区带也不增加。,（5）.2球蛋白缺陷型：主要特征：2球蛋白带有时可轻度减低，其它组分多正常。产生原因：在此区带出现缺陷的主要有结合珠蛋白、血浆 铜蓝蛋白，分别称无结合珠蛋白血症和铜蓝蛋 白缺乏症。前者极少见，没有特别症状，有时 可伴有轻度贫血。铜蓝蛋白缺陷已知有Willson 氏病，特别在肝、脑和角膜较多。,3、r球蛋白增多与M蛋白正常SPE中球蛋白区带：IgG；IgM；IgA；IgD；IgEM蛋白是浆细胞或B淋巴细胞单克隆恶性增殖所产生的一种大量的异常免疫球蛋白，因其多见于多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)及恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)，都是以M开头的疾病，故称为“M蛋白”。,特点是区带窄而浓,扫描峰高而尖,基底部窄,在区高与宽的比例2,区则1(正常时小于此比例),其他区带明显减少。,三、血浆蛋白质种类及其异常,1、前白蛋白（prealbumin,PA）：分子量5.4万，由肝细胞合成。在pH8.6电泳中移速比白蛋白快而得名。功能：营养 半衰期12小时；运载 结合T3、T4、结合维生素A。意义：测定其在血浆中的浓度对于了解蛋白质的营养不良和肝功能不全，比白蛋白和TFR具有更高的敏感性，在急性炎症、恶性肿瘤、肝硬化或肾炎时其浓度下降。,2、白蛋白（aibumin,Alb)：由肝实质细胞合成，半衰期1519天，含量最多的蛋白质，占40%60%。在肝细胞中没有贮存。分子结构1975年阐明，含585个氨基酸残基的单链多肽，分子量66458，含17个二硫键（SS），不含糖的组分。功能运载：胆红素、长链脂肪酸、胆汁酸盐、前列腺素、类固醇激素、金属离子（铜、镍、钙等）；营养：内源性氨基酸维持血浆蛋白质胶体渗透压、缓冲酸碱作用。血液中80的渗透压是由白蛋白承担的。,临床意义可以作为个体营养状态的评价指标血浆白蛋白明显减少时，可以影响许多配体在循环血液中的存在形式；白蛋白增高较少见，在严重失水时，对监测血浓缩有诊断意义；,白蛋白减少在不少疾病时常见：白蛋白的合成减少急性或慢性肝炎；营养不连或吸收不良；遗传性缺陷无白蛋白血症是一种极少见的代谢性缺损，血浆白蛋白含量常低于1g/L，但可以没有症状（如水肿等），可能部分由于血浆中球蛋白含量代偿性升高；组织损伤（外科手术或创伤）或炎症（感染性疾病）引起的白蛋白分解代谢增加；白蛋白的异常丢失肾病综合症、慢性肾小球肾炎、糖尿病、SLE等尿中白蛋白损失，烧伤及渗出性皮炎可以从皮肤丧失大量蛋白质；白蛋白的分布异常门静脉高压引起腹水中有大量蛋白质。是从血管内渗漏入腹腔。白蛋白的遗传变异：已发现20多中种。,3、a1酸性糖蛋白（AAG）：分子量近4万，含糖约45%，pI为，包括等分子的已糖、已糖胺和唾液酸。AAG是主要的急性时相反应蛋白，在急性炎症时增高，显然与免疫防御功能有关明。早期工作认为肝是合成1-糖蛋白的唯一器官，近年有证据认为某些肿瘤组织亦可以合成。,4、a1抗胰蛋白酶（AAT）：是具有蛋白酶抑制作用的一种急性时相反应蛋白，分子量为5.5万，P1值4.8，含有10%-12%糖。在醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳中泳动于1区带，是这一区带的主要组分。区带中的另2个主要组分；1-酸性糖蛋白含糖量特别高，1-脂蛋白含脂类特别高，因此蛋白质的染色都很浅。作为蛋白酶的抑制物，它不仅作用于胰蛋白酶，同时也作用于糜蛋白酶、尿激酶、肾素、胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶和凝血酶等。AAT占血清中抑制蛋白酶活力的90%左右。AAT的抑制作用有明显的pH依赖性，最大活力处于中性和弱碱性，当pH4.5时活性基本丧失，这一特点具有重要的生理意义。,AAT具有多种遗传分型，利用不同pH的缓冲剂和电泳支持物，迄今已分离鉴定有33种等位基因（allotypes），其中最多见的是PiMM型（为M型蛋白抑制物的纯合子体）占人群的90%以上，另外还有两种蛋白称为Z型和S型，可表现为以下遗传分型：PiZZ、PiSS、PiSZ、PiMZ、PiMS，S型蛋白与M蛋白之间的氨基酸残基仅有一个差异。对蛋白酶的抑制作用主要限于血循环中M型蛋白的浓度。以MM型的蛋白酶抑制能力为100%相比，ZZ型的相对活力仅为15%、SS为60%、MZ为57%、MS为80%，其它则无活性。,5、甲胎蛋白（-fetoprotein,FP或AFP）主要在胎儿肝中合成，分子量6.9万，在胎儿13周AFP占血浆蛋白总量的1/3。在妊娠30周达最高峰，以后逐渐下降，出生时血浆中浓度为高峰期的1%左右，约40mg/L，在周岁时接近成人水平（低于30mg/L）。,甲胎蛋白在产妇羊水或母体血浆中AFP可用于胎儿产前监测。如在神经管缺损、脊柱裂、无脑儿等时，AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量显著升高。胎儿在宫腔内死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可经羊水部分进入母体血循环。在85%脊柱裂及无脑儿的母体，血浆AFP在妊娠16-18周可见升高而有诊断价值，但必须与临床经验结合，以免出现假阳性的错误。,6、结合珠蛋白（haptoglobin，hp）：触珠蛋白是人血清中能与游离血红蛋白（hb）在血浆中与游离的血红蛋白结合，是一种急性时相反应蛋白。在CAM电泳及琼脂糖凝胶电泳中位于2区带。分子中有两对肽链（与链）形成22四聚体。链有1及2两种。,7、a2巨球蛋白（a2Macroglobulin，a2MG）是溶纤维蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和禅性蛋白酶等多种蛋白水解酶的抑制剂，是存在于血液中的具有重要生物活性的大分子的糖蛋白，分子量725000，由肝脏的淋巴细胞、单核细胞及纤维母细胞合成和释放，对血中内源性、外源性蛋白水解酶有清除作用。,8、铜蓝蛋白（ceruloplasmin,CER）是一种含铜的2糖蛋白，分子量约为12万-16万，不易纯化。目前所知为一个单链多肽，每分子含6-7个铜原子，由于含铜而呈蓝色，含糖约10%，末端唾液酸与多肽链连接，具有遗传上的基因多形性。CER具有氧化酶的活性，对多酚及多胺类底物有催化其氧化的能力。最近研究认为CER可催化Fe2+氧化为Fe3+。,9、转铁蛋白:（transferrin，TRF，siderophilin）是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。以TRF-Fe3+的复合物形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。TRF分子量约7.7万，为单链糖蛋白，含糖量约6%。TRF可逆地结合多价离子，包括铁、铜、锌、钴等。每一分子TRF可结合两个三价铁原子。TRF主要由肝细胞合成，半寿期为7天。血浆中TRF的浓度受铁供应的调节，在缺铁状态时，血浆TRF浓度上升，经铁有效治疗后恢复到正常水平。,10、10、C反应蛋白（Creactive protein,CRP)CRP由肝细胞所合成。CRP含5个多肽链亚单位，非共价地结合为盘形多聚体。分子量为11.5万-14万。电泳分布在慢区带，有时可以延伸到区带。其电泳迁移率易受一些因素影响，如钙离子及缓冲液的成分。,临床意义：CRP作为急性时相蛋白在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗塞、手术创伤、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高，并有成倍增长之势。病变好转时，又迅速降至正常，其升高幅度与感染的程度呈正相关。CRP与其它炎症因子的相关性：CRP与其它炎症因子如白细胞总数、红细胞沉降率和多形核白细胞等具有密切相关性。CRP与WBC存在正相关。在炎症反应中起着积极作用，使人体具有非特异性抵抗力。在患者疾病发作时，CRP可早于WBC而上升，回复正常也很快。故具有极高的敏感性。,CRP可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断：一旦发生炎症，CRP水平即升高，而病毒性感染CRP大都正常。脓毒血症CRP迅速升高，而依赖血培养则至少需要48小时，且其阳性率不高。又如CRP能快速有效地检测细菌性脑膜炎，其阳性率达99。恶性肿瘤患者CRP大都升高。如CRP与AFP的联合检测，可用于肝癌与肝脏良性疾病的鉴别诊断。CRP测定用于肿瘤的治疗和预后有积极意义。手术前CRP上升，手术后则下降，且其反应不受放疗、化疗和皮质激素治疗的影响，有助于临床估价肿瘤的进程。CRP用于评估急性胰腺炎的严重程度。当CRP高于250L时，则可提示为广泛坏死性胰腺炎。正常参考值：10L,11、血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA)是一种急性时限反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12 000。在急性时限反应中，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000 倍，但半衰期极短，只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白 A 与高密度脂蛋白(HDL)有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。血清淀粉样蛋白 A 一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白 A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。,与 C 反应蛋白(CRP)类似，血清淀粉样蛋白 A 的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。,注意：正性APRP：升高 如：AAT、AAG、Hp、Cp、C4、C3、CRP和纤维蛋白原。负性APRP：降低 如：PA、ALB、TRF。2-MG不是APRP。,以%表示：Alb:57%68%1:1.0%5.7%2:4.9%11.2%:7%13%:9.8%18.2%,以g/L表示：Alb:3552 g/L1:1.04.0 g/L 2:4.08.0 g/L:5.010.0 g/L:6.013.0 g/L,血清蛋白电泳的正常组分,四、血清电泳组分分析,图形分析,直接法：电泳染色后，直接观察图形的变 化，大概判断各区带的增减。如需定量，可进一步脱色、比色。光密度扫描法：可直接观察各区带的扫描图 形，且可以以数值表示各组分的含量。,怎样判断蛋白电泳图谱,区带的外观：（估算）区带的浓度：测定区带Pr含量（相对值），洗脱法或直接光密度。波峰（光密度扫描）：同一浓度下，波峰的高度和宽度与Pr的纯度密切相关。均一Pr：形成一个窄、顶尖和峰高的波峰 数种Pr：形成一个宽、顶平和峰低的波峰,异常电泳图谱的临床意义,异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征图谱类型 TP Alb 1 2 肾病型 不定肝硬化型 N N N-融合 急性炎症 N N N慢性炎症 蛋白质缺乏型 个别区带出现特征性缺乏,M蛋白血症型,在-区带中间出现M蛋白区带,(1)急性和慢性炎症,主要特征：白蛋白减少或正常，1和2球蛋白增高，当有明显的急性炎症病灶时，可显著增高。炎症转为慢性时其增加程度减低。球蛋白增高不明显，当炎症转为慢性时，可明显增加。,（2）肾脏疾病,肾脏疾病常有血浆蛋白质的丢失。蛋白尿包括肾小球性、肾小管性和混合性蛋白尿三类。肾小球性蛋白尿：以中分子量为主，如TRF等，称选择性蛋白尿;可见于肾小球性肾炎、糖尿病、自身免疫性疾病等。肾小管性蛋白尿:主要是相对小分子质量的蛋白质排泄增多，如:2-微球蛋白（2-M）。可见于肾盂肾炎，肾血管性疾病等。混合性蛋白尿：兼有肾小球滤过功能与肾小管重吸收功能的障碍。严重肾病致肾小球失去分子筛作用，出现非选择性蛋白尿，可表现为广泛的低血浆蛋白质血症。,主要特征：此图形的分子筛效应明显，为典型的选择性蛋白漏出型图形，其特征为白蛋白明显减低，1球蛋白轻度增,2球蛋白明显增加，球蛋减低、正常或增高。成人肾病综合征时,球蛋白通常增加，特别是狼疮性肾炎淀粉样肾病等，球蛋白则明显增加。,病理分析：肾小球损伤 Alb TP Alb 1（主要是1-AG）2-MG、2,选择性蛋白质丢失的特征,Alb区带：Alb明显低下，PA也下降1-球蛋白区带：AAG，AAT下降，AAG合成增加2-球蛋白区带：AMG和Hp增加-球蛋白区带：-Lp增加，TRF下降-球蛋白区带：IgG降低，IgM可有增加,不定,低白蛋白血症型,（3）肝脏疾病,+(),主要特征：清蛋白在所有病例中均有不同程度的减低，1、2和球蛋白正常或降低，球蛋白常明显增高，区带的宽度也明显增加，可见-桥，为本病的特征。根据-桥的程度可将其分为三型。,Alb带:PA，Alb明显降低1-带：AAT增高显著,AAG偏低2-带：Cp轻度升高，AMG明显增 高；Hp偏低-带：TRF明显降低-带：IgG弥散性增高，IgA明显升 高；CRP轻度升高。,肝硬化,第型：和区带连成一片，难于分开，称为-桥。此型除见于极少数结缔组织疾病外，几乎全见于肝硬化，如见到-桥，并伴有1和2球蛋白减少时可确诊为肝硬化，故将此型称为肝硬化型。第型：有-桥存在，但在与区带之间仍可见一浅谷，两者可分开，称为不完全性-桥，但仅据此尚不能诊断为肝硬化，仅能作出提示诊断，故将此型称为提示肝硬化型。第型：为非特异型，与区带能明显分离，没有形成-桥，与其它原因所致的高球蛋白血症完全不能区别。,病理分析:-桥的出现与血清免疫球 蛋白,特别是IgG、IgA、IgM同时 增加有关,其中又以IgA影响较大,IgA IgM泳动在2与之间时,使 与区融合而形成-桥。,原发性肝癌型,主要特征：白蛋白和1球蛋白之间有一小的甲胎蛋白带。,AFP,（4）M蛋白血症,M蛋白血症：浆细胞病时，异常浆细胞克隆增 殖,产生大量单克隆免疫球蛋白或其轻链或重链片段，病人血清或尿液中可出现结构单一的M蛋白。三种类型：免疫球蛋白型：IgE、IgA、IgM或IgD的一种轻链型：由于K或轻链合成超过重链，而游 离于血清重链型：浆细胞只产生免疫球蛋白的重链或有缺陷的重链,主要特征：在电泳图形上，出现异常浓 集色泽深染的窄区带，此区带多出 现在或区，偶见于区。用光 密度计扫描，可见到尖锐的高峰。（其宽窄是与ALB区带相较，若大致相 等或窄，应考虑M蛋白）,IgG 型多发性骨髓瘤,M区带,特点：多出现于到慢区，且较IgA或 IgM形成的M蛋白区带窄而浓集。如果浓度很高，可形成象小波浪的蛋白带。,IgA 型多发性骨髓瘤,M区带,特点：可出现于2、区。多出现和之间。,代表性疾病：多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、重链病、轻链病、自身免疫性疾病、淋巴肉瘤、良性M蛋白血症等。,四、尿液蛋白质,1、2-微球蛋白（2-microglobulin,BMG）分子量为11800，存在于所有有核细胞的表面，特别是淋巴细胞和肿瘤细胞，并由此释放入血循环。它是细胞表面人类淋巴细胞抗原（HLA）的链（轻链）部分（为一条单链多肽），分子内含一对二硫键，不含糖。半寿期约107分钟，可透过肾小球，但尿仅有滤过量的1%，几乎完全可由肾小管回收。2-微球蛋白在肾功能衰竭、炎症及肿瘤时，血浆中浓度可升高。主要的临床应用在于监测肾小管功能。特别用于肾移植后，如有排斥反应影响肾小管功能时，可出现尿中BMG排出量增加。在急性白血病和淋巴瘤有神经系统浸润时，脑脊液中BMG可增高。因含量微，常用放射免疫方法测定，正常血浆BMG参考值为1.0-2.6g/L，尿中。,增高：见于近端肾小管损害自身免疫性疾病恶性肿瘤肝病脏器移植后的排斥反应艾滋病等尿2微球蛋白增高见于急性或慢性肾小球肾炎尿毒症糖尿病肾病系统性红斑狼疮累及肾病变肾盂肾炎先天性Fanconi综合征Wilson病镉金属中毒以及摄入庆大霉素硝苯地平（心痛定）妥布霉素等药物减低：见于急性或慢性肾小球肾炎肾病综合征等,四、尿液蛋白质,2、1-微球蛋白：1-Microglobulin.1M 用于评价近曲小管对滤过的微小蛋白重吸收的功能和容量。肝细胞和淋巴细胞可合成1M，其相对分子量在2533KD之间，等电点pH为3.64.4。1M也称作蛋白质HC，据报导有免疫抑制性，它对抗原诱导的淋巴细胞的激活和嗜中性白细胞的向化性具有抑制作用。部分1M在血清中以游离分子状态出现。也有一部分外于IgA和蛋白结合状态中。肾脏中一定量的肾小球滤过液后，被近曲小管的上皮细胞接纳，再通过特异的内吞作用机制重吸收，在这些细胞的溶酶体中代谢。所以健康人的尿中只有痕量的2M、1M、视黄醇结合蛋白和人免疫球蛋白轻链的存在。,1M是低分子量血浆蛋白（LMW）的一种，有内种机制会导致尿中LMW蛋白浓度的增加：肾小球滤出率保持不变，损害肾小管重吸收（肾小管蛋白尿）；血浆中LMW蛋白浓度增加（例如，合成的增加或肾功能不全）会导致滤出量的增加，造成LMW蛋白质的肾小管内吞容量负担加重；两种机制兼而有之。故LMW蛋白是肾小管重吸收功能障碍的合适标志。1M与2M有着相似的性质，但优点是在酸性尿的pH范围内1M有着更高的稳定性，同时在“无肌酸酐”条件下（血清）对于肾功能不全是灵敏度最高的一种标记物。正常值：痕量（透射浊度法）,第二节 体液蛋白质测定,总蛋白测定,个别蛋白质的测定,蛋白分离测定技术,发展趋势:,测定体液标本:,血浆：普遍,尿液，脑脊液和胸腹水等：有选择性的组织病变检查,免疫化学法特异定量个别蛋白质,体液蛋白质的测定方法概括：,常规：免疫浊度法、免疫扩散法，免疫电泳法，微量：放射免疫测定（RIA），酶免疫测定法（ELA/ELISA）,电泳测定：,定量化学测定TPr，Alb,电泳 组成图谱 半定量 定量,染料结合法，UV法，折光法等,一、血清总蛋白测定,假设：,、纯多肽链，含氮量平均为16%、各种蛋白质与化学试剂反应性一致，仅为相对定量,测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质,1、元素组成测定：含N稳定；2、重复的肽链结构：具有多个肽键；3、酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色或UV 吸收；4、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接；5、沉淀后借浊度测定：光度计测定；6、光折射测定：折射仪测定。,方法：,1.凯氏定氮法参考方法2.双缩脲法(推荐)3.酚试剂法4.散射比浊法5.染料结合法6.UV 法.折光测定法,1.凯氏定氮法参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro),消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；吸收用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使H+）滴定用已标定的无机酸滴（使H+恢复），计算总氮量定蛋白（总氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量,纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含量成正比。,原理：,三聚氰胺化学式：C3N6H6，分子量：126 含氮量达66%。,评价：,优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。,应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法,2.双 缩脲法,原 理：,蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。,条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反 应,三肽以上才能反应。,双缩脲生成,评价：,优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%2%，显色稳定。缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。,应用：常规推荐方法。手工或上机使用。,3.酚试剂法(Folin试剂法）,原理：,蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，,Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+，提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。吸收峰为745-750nm。,评价及应用：,优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-60g），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。,4.比浊法,原理：,评价及应用：,优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）,某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。,5.染料结合法,在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。,原理：,常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等,考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。,评价及应用：优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。,6.紫外分光光度法,（1）蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。（1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 A 280-0.74 A 260（2）Warburg-Christian 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55 A 280-0.76 A 260,原理：,评价及应用：,优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；核酸在206nm有最大吸收，在280nm有较大吸收，导致准确性和特异性受影响。措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。,（2）稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。常用下列经验公式：蛋白质浓度（mg/mL）=0.144（A215-A225）,7.折光测定法,溶解在溶液中的固体可增加溶液的光折射率，在固定波长和温度下，光折射率和血清中蛋白质含量成正比。,原理：,评价及应用：,优点：简便、快速，易掌握，重复性较好，适合临床急诊，体检筛查和胸腹水蛋白质测定。缺点：准确性较差，易受高血脂症，高胆红素血症以及溶血等因素影响，会由于A/G比值变化而产生误差。,参考范围：成人6080g/L,临床意义：,总蛋白升高：,总蛋白降低：丢失过多 消耗增加 白蛋白合成减少 水肿,真性升高：MM、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等,假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高，A/G几乎不变,二、血清白蛋白测定,方法：,1.染料结合法(推荐)2.盐析法3.电泳法4.免疫化学法,1.染料结合法(推荐),原理:血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。,染料,BCG,BCP,优点,缺点,易于和非人源性白蛋白结合 与白蛋白结合特异性较差,与非人源性白蛋白结合力弱 与白蛋白结合特异性好,在30秒内测可提高特异性,应用及评价:,严格控制反应时间的BCG法既适合手工也适合自动化分析。临床上推荐使用。,原理:盐析是由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚集而沉淀析出。各种蛋白质的亲水性和带电荷不同，故盐析时所需盐浓度与pH不同。GLB在生理pH下带电荷及水化膜比ALB少，可被较低浓度中性盐沉淀。,2.盐析法,中性盐：硫酸铵、硫酸钠等,应用及评价:,操作繁琐，不宜自动化，基本不用,