《蛋白质的结构》PPT课件.ppt

五、蛋白质的结构,(一)、蛋白质分子的概念蛋白质分子：由一条或一条以上的多肽(polypeptide)链按各自特殊的方式组合而成的具有完整生物活性的蛋白质的最小单位。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,（二）、蛋白质的一级结构(primary structure)（初级结构、肽链结构、化学结构）,1.定义：指蛋白质分子中氨基酸连接成肽链的方式和排列顺序。是蛋白质最基本的结构,它是由基因上遗传密码的排列顺序决定的。它是蛋白质生物功能的基础。,2.蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,基本要求：a、样品必需纯（97%以上）；b、知道蛋白质的分子量；c、知道蛋白质由几个亚基组成；,（1）测定蛋白质一级结构的原则,遵循原则：（1）提纯蛋白质样品。（2）测定NH2末端基的数目，由此确定蛋白质分子由几条链组成。（3）拆开二硫键，将蛋白质分子中的几条链拆开，并分离出每条肽链得到伸展的肽链。（4）肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成，由此确定各种氨基酸成分的分子比（5）肽链的另一部分样品进行NH2和COOH末端基鉴定。（6）应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各得到一系列大小不同的肽段。（7）分离提纯所产生的每个肽段，并测定其氨基酸顺序。（8）从有重叠结构的各个肽的氨基酸顺序中推断出蛋白质中全部氨基酸排列顺序。,（1）测定蛋白质一级结构的原则,（2）常用测定方法简介,A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,（2）常用测定方法简介,B.多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,（2）常用测定方法简介,B.多肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,（2）常用测定方法简介,C.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,S,S,S,S,S,S,胰岛素,HO-CH2-CH2-SH,SH,SH,SH,SH,SH,SH,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,ICH2COOH,C.二硫键的断裂,（2）常用测定方法简介,C.二硫键的断裂应用过甲酸氧化法拆分二硫键。,蛋白质一级结构的测定,s,s,HcoooH,SO3H,SO3H,（2）常用测定方法简介,D.分析多肽链的N-末端和C-末端。多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,蛋白质一级结构的测定,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端基氨基酸测定,二硝基氟苯（DNFB）法,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。,苯异硫氰酸酯（Edman）法,末端基氨基酸测定,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,末端基氨基酸测定,丹磺酰氯法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,末端基氨基酸测定,肼解法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端基氨基酸测定,氨肽酶(amino peptidases)法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,末端基氨基酸测定,羧肽酶(carboxypeptidase)法,（2）常用测定方法简介,E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定,多肽链断裂法：酶解法和化学法,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,Trypsinase：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,胰蛋白酶,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,糜蛋白酶,Pepsin：R1Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R2=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,thermolysin：R2=Leu、Ile、Phe、Tyr、Val、Trp、Met 等疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly 水解受抑。R1或R3=Pro 水解受抑。,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,谷氨酸蛋白酶：R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液);R1=Glu(磷酸缓冲液或醋酸缓冲液)精氨酸蛋白酶：R1=Arg,肽链,水解位点,谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶,化学法：可获得较大的肽段溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,化学法：可获得较大的肽段羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。,多肽链的选择性降解,胃蛋白酶：R1=Phe、Trp、Tyr或其它氨基酸 嗜热菌蛋白酶：R2=Leu、Ile、Phe、Tyr、Val、Trp、Met 等 溴化氰法:R1=Met(化学方法),胰蛋白酶（胰梅）：R1=Lye&Arg,糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1=Phe、Trp&Tyr,小结,（2）常用测定方法简介,F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。,Edman氨基酸顺序分析法,测定每条多肽链的氨基酸组成,蛋白质一级结构的测定,（2）常用测定方法简介,G.确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,示例(十肽的水解),A法水解得到四个小肽：A1 Ala-Phe A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A3 Arg-Tyr A4 His-ValB法水解得到四个小肽：B1 Ala-Phe-Gly-Lys B2 Asn-Tyr-Arg B3 Tyr-His-Val,（三）蛋白质的空间结构,1、概念 蛋白质的空间结构（或构象、高级结构）：指蛋白质分子中原子或基团在空间的排列分布和肽链的走向。包括二、(超二级结构、结构域）三、四级结构。,构型（configuration）：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。COOH COOHH2N C H H C NH2 R R构象（conformation）:指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。,概念,肽键平面或酰胺平面：由于肽键中C-N具有部分双键的性质，不能旋转，使得肽键中的四个原子和与之相邻的两个-碳原子共处于一个平面，此平面就称为肽键平面或酰胺平面,概念,蛋白质的构象：蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH条件下，只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物学活性，并且相当稳定。,概念,蛋白质的构象,蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现：1.肽键具有部分双键性质：2.肽键不能自由旋转 3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个碳原子（C）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane）。,定义：蛋白质的二级(Secondary)结构又叫主链构象，是指多肽链的主链本身（主链骨架）在空间的排列、旋转及折叠，并以氢键维系，而形成的有规则的构象。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。氢键是稳定二级结构的主要作用力。主要有-螺旋、-折叠、-转角、自由回转。,2、蛋白质的二级结构,.-螺旋结构及其特点,螺旋构象：指多肽链骨架围绕螺旋中心轴一圈一圈地上升而形成的螺旋式的空间结构。根据氢键形成的方式不同，可分为-系螺旋和-系螺旋两大类。-螺旋是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构。,C,N,N,C,多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。-螺旋的书写形式为：3.613-螺旋,结构特点,肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。-螺旋的书写形式为：3.613-螺旋-螺旋有左手螺旋和右手螺旋之别，右手螺旋即从R-CH-NH-端（C-末端）作起点围绕中心轴向右盘旋。右手螺旋比左手螺旋稳定。蛋白质中的-螺旋几乎都是右手螺旋。氨基酸的侧链R-基团均伸向外侧，本身不参与-螺旋，但可以影响螺旋的稳定性及形成，有以下几种情况：,结构特点,氨基酸的侧链R-基团均伸向外侧，本身不参与-螺旋，但可以影响螺旋的稳定性及形成。R-基团对-螺旋稳定性及形成的影响：A、当氨基酸残基R基团不太大时，在非极性情况下就很容易参加到-螺旋中去。B、当连续出现带相同电荷的R基团时，肽链不能形成-螺旋，该处呈不规则的伸展状态。,结构特点,R-基团对-螺旋稳定性及形成的影响：B、当连续出现带相同电荷的R基团时，肽链不能形成-螺旋，该处呈不规则的伸展状态C、甘氨酸（Gly）不易参加到-螺旋中去，因R=H，小而活泼，转动时受空间阻碍小，不稳定。D、脯和羟脯氨酸也不能参加到-螺旋中去，因为其亚氨基已参加肽键的形成，没有H来参加氢键的形成，故螺旋至此形成“结节”。,结构特点,(2)-折叠（-pleated sheet）,-折叠或-折叠片也称-结构或-构 象，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，肽链的主链呈锯齿状折叠构象,-折叠(-pleated sheet),-折叠的特点,A、肽链骨架是一种较为伸展的据齿状构象B、由两条或两条以上的肽链才能形成。C、肽链平行排列，相邻主链骨架之间借氢键彼此连成片层结构，维持其构象的稳定。（羰基氧与亚氨基氢之间形成氢键）,-折叠的特点,C、肽链平行排列，相邻主链骨架之间借氢键彼此连成片层结构，维持其构象的稳定。（羰基氧与亚氨基氢之间形成氢键）D、氢键与链的长轴接近垂直，所有的肽键都参与链间氢键的形成。E、与C原子相连的侧链（R）交替的位于片层的上方和下方，它们均与片层相垂直,-折叠的特点,E、与C原子相连的侧链（R）交替的位于片层的上方和下方，它们均与片层相垂直。F、-折叠具有平行式（-角蛋白）和反平行式（丝心蛋白）两种类型,(3)-转角(-turn)亦称：-reverse turn,-bend,在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,(4)-凸起（-bugle）,指无一定规律的松散盘曲的肽链结构。酶的功能部位常包含此构象，灵活易变。,(5)无规卷曲或自由回转（nonregular coil）,3.超二级结构和结构域,(1).超二级结构(supersecondary structure)定义：指蛋白质中相邻的二级结构单位（-螺旋或-折叠或-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。类型：超二级结构的基本类型：、等,示例：纤维状蛋白,角蛋白,胶原蛋白,-角蛋白（头发）,-角蛋白（丝心）,弹性蛋白,3.超二级结构和结构域,(2)结构域（domain，域结构）：指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上，进一步卷曲、折叠形成几个相对独立、近似球形的三维实体。,域结构是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。,结构域与分子整体以共价键相连具有相对独立的空间构象和生物学功能同一蛋白质中的结构域可以相同或不同，不同蛋白质中的结构域也可能相同或不同,(2).结构域（domain，域结构）：,域结构是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。,纤维状蛋白 纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外表保护成分，占脊椎动物体内蛋白质总量的一半成一半以上。这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴短轴)大于10(小于10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肽链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。,示例：纤维状蛋白,角蛋白,胶原蛋白,-角蛋白（头发）,-角蛋白（丝心）,弹性蛋白,纤维状蛋白质的类型,纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白)和可溶性两类，前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等；后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等，但不包括微管(microtubule)和肌动蛋白细丝(actin filament)，它们是球状蛋白质的长向聚集体(aggregate)。,A.角蛋白 Keratin,角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。角蛋白中主要的是-角蛋白。-角蛋白主要由-螺旋构象的多肽链组成。一般是由两条右手-螺旋肽链形成一个原纤维（向左缠绕），原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。-角蛋白的伸缩性能很好，当-角蛋白被过度拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时-角蛋白转变成-折叠结构，称为-角蛋白。,毛发的结构,一根毛发周围是一层鳞状细胞(scaIe cell)，中间为皮层细胞(cortical celI)。皮层细胞横截面直径约为20m。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。毛发性能就决定于螺旋结构以及这样的组织方式。,角蛋白分子中的二硫键,卷发(烫发)的生物化学基础,永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。这是因为角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在构象状态，此外角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。,B.-角蛋白,丝心蛋白(fibroin)：这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。丝心蛋白是典型的反平行式-折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象。,丝蛋白的结构,丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向-折叠结构。分子中不含-螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）-,4.蛋白质的三级结构,(1)定义：蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。,（2）、特点（球状蛋白）A、整个分子的外形为球形或椭球形，分子比较紧密。B、分子内部有一个疏水核，由非极性基团为了避开水卷入到分子内部而形成。C、分子表面是极性的，形成一个亲水的外壳，亲水外壳由于极性基团位于表面而形成。D、分子的表面上有一个深陷区的裂隙，该处为球状蛋白质分子的活性部位或是与配基结合的部位，即功能部位。,示例：肌红蛋白的结构与功能,示例：肌红蛋白的结构与功能,（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。（2）肌红蛋白的结构特点：1963年，Kendrew a.一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基（分子量17800）组成。,示例：肌红蛋白的结构与功能,（2）肌红蛋白的结构特点：1963年，Kendrew b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段较直的-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。,三级结构小结,长度缩短：球形、椭球形、杆状，等多数同时含有-螺旋和-折叠氨基酸位置由侧链极性决定：非极性（内）、极性（表面，少数内部）、带电（表面）次级键维系：疏水键、盐键、氢键、范德华力功能区：表面或特定部位,5.蛋白质的四级结构,指两条或两条以上具有三级结构的多肽链以非共价键结合在一起构成了具有完整的生物学功能的蛋白质分子（称为寡聚蛋白），多肽链之间的这种聚合称为蛋白质的四级结构。亚单位（亚基）：指构成寡聚蛋白的具有三级结构的多肽链。亚基单独存在时无生物活性或活性很低。,(1).定义：,5.蛋白质的四级结构,亚单位（亚基）：指构成寡聚蛋白的具有三级结构的多肽链。亚基单独存在时无生物活性或活性很低。通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连。亦可以说，具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白或多体蛋白。（寡聚蛋白中亚基可以是相同的或不相同的，亚基相同时，分子具有对称性）实质：蛋白质的四级结构实际上研究亚基之间的相互作用、空间排布及亚基接触部位的空间布局。,(1).定义,5.蛋白质的四级结构,A、亚基之间以非共价键（次级键）相连。B、具有四级结构的蛋白质分子只有构成四级结构时才有完整的生物学功能。C、亚单位（亚基）具有独立的三级结构。,(2)特点,(3)维持蛋白质四级结构的主要作用力,在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。即亚基之间通过次级键彼此缔合在一起疏水键是最主要的作用力（特别是三级结构）。,肽键 共价键 二硫键 氢键 疏水键 次级键（非共价键）范德华力 盐键,（四）蛋白质分子中的重要化学键,蛋白质分子中的化学键,