《蛋白质的复性》PPT课件.ppt

蛋白质的复性,蛋白质的复性,为什么要进行蛋白质的复性？外源基因导入E.coli等宿主细胞并表达蛋白质产物（r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素等）时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质的活性。所以要进行蛋白质的复性。1.什么是包涵体？2.为什么选择原核表达系统（特别是 E.coli）？,蛋白质复性,包含体（inclusion body,IB）是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌细胞中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与细胞质中的其他成分有明显的区别。,蛋白质复性,包含体形成的原因 包涵体的形成比较复杂，有些机理还不清楚；(1)表达量过高：包含体的形成与细胞内蛋白质的生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；(2)包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度、氧化还原电势及蛋白质转运系统的功能等因素有关。(3)大肠杆菌的生长过程在受到某些因素的影响时，其本身蛋白质的表达也可出现异常，造成蛋白质的聚集从而形成包含体。,蛋白质复性,包含体形成的原因（4）重组蛋白的氨基酸组成（5）重组蛋白时大肠杆菌的异源蛋白，缺乏一些蛋白折叠过程中所需要的酶和辅助因子。（6）在细菌表达蛋白过程中，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。,蛋白质复性,包含体的形成的优势 形成包含体对克隆基因的表达产物蛋白质具有保护作用，大肠杆菌可产生蛋白质水解酶，可降解不稳定的多肽，许多可溶性的重组蛋白质对这些酶敏感，使得利用细菌作为表达宿主时受到限制，然而隔离在包含体内的蛋白质可免受蛋白酶的降解作用；此外对宿主菌有毒性的重组蛋白以无活性聚集体的形式存在也可以降低对宿主菌的毒害作用。,优势:包含体可避免被水解酶水解,蛋白质复性,包含体的理化特性大部分包含体不能渗透出细胞，需要人工进行细胞破碎来进行释放产物。大部分包含体在细胞内凝聚成没有活性的颗粒固体（r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素）特点：包含体组成基本上由蛋白质构成，其中大部分（占50%以上）是基因工程产品，产物一级结构是正确的，但立体结构是错误的，没有生物学活性。,蛋白质复性,基因表达系统一般分为真核表达系统和原核表达系统。由于真核表达系统如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等产生的重组蛋白价格高、产量低，而且操作复杂、产品周期长，而原核表达系统培养成本低、生长快、表达量高、基因操作方便，因此，目前它们仍是基因工程的主要表达系统，特别是大肠杆菌。大肠杆菌的重组菌 有多种可选择的质粒；重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；蛋白表达量高（可达总蛋白50）；但原核表达系统也有一个问题，很多外源蛋白在E.coli细胞内表达时往往以不溶的，无活性的包含体形式存在。若能解决包含体问题，原核表达系统就可得到更广泛的应用。,蛋白质复性,现就包含体形成的预防、分离、溶解、复性作一综述。1.预防包含体形成的方法2.包含体的分离、溶解3.包含体的复性,蛋白质复性,预防包含体形成的方法1.形成分子伴侣,分子伴侣是什么 参与协助新生肽链体内折叠的一类蛋白质，包括：核质素，热休克蛋白60家族（Hsp60），热休克蛋白70家族（Hsp70），热休克蛋白90家族（Hsp90）和其他种类的分子伴侣 分子伴侣对新生肽链折叠的促进作用 使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力；在肽链折叠过程中通过与折叠中间体上暴露的疏水区域结合而防止肽链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径 应用分子伴侣的策略 可采用表达外源基因的同时，共表达分子伴侣的策略。例如，GroES和GroEL可显著提高D-核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶（rubisco）的折叠、组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶A脱氢酶的产量和组装效率；对可溶性-葡萄糖苷酶的表达也有提高,蛋白质复性,预防包含体形成的方法 2.通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性.为了使外源蛋白在E.coli细胞中可溶性，人们在培养条件的优化方面进行了多方面的探索。（I）通过降低培养温度可以使人干扰素2和干扰素的可溶性组分提高。这些蛋白在37下表达时以包含体形式存在，当将培养温度降到2330时,其可溶性组分可达30%90%。,蛋白质复性,预防包含体形成的方法 2.通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性.为了使外源蛋白在E.coli细胞中可溶性，人们在培养条件的优化方面进行了多方面的探索。（II）利用丰富培养基,可使T4噬菌体的脱氧胞苷酸脱氨酶的基因进行可溶性表达，表达量占细胞可溶性蛋白总量的20%，而在最低培养基中，此酶以包含体形式表达。（III）改变培养基的渗透压、降低pH值等方法也可以达到减少包含体的目的。通过优化发酵条件改善基因表达产物的方法虽然可行，然而也需要对具体问题进行具体分析、实验。,蛋白质复性,预防包含体形成的方法 3通过基因突变技术，在蛋白分子中产生氨基酸取代，来增加重组蛋白的可溶性。此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性受到影响。通过氨基酸取代，改变蛋白质表面荷电性质，减少蛋白分子之间聚集，从而防止包含体的形成。如上所述，多种因素影响外源基因的可溶性表达。对于如何获得天然构象和活性的可溶蛋白质的技术方法，目前均无统一的模式，只能通过具体实验来确定。,蛋白质复性,蛋白质复性的主要步骤：破碎细胞 分离出包含体 溶解包含体目标构建的构型复原 对复性蛋白进行纯化获得高纯度的蛋白。包含体颗粒内并不一定多是表达产物，也可能含有其他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等.,蛋白质复性,主要蛋白质复性的基本步骤和联合实验如下：（1）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法）离心法提取出包含体 加变性剂溶解 除变性剂复性。（2）机械破碎 膜分离可溶性蛋白 变性溶解包含体 除变性剂复性。（3）化学破碎（加变性剂）离心除细胞碎片 出除变性剂复性。,蛋白质复性,路线1的特点：方法（1）：利用了包含体与细胞破碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性性蛋白质分开，获得包含体，再对包含体溶解后，复性，摆脱大量的杂蛋白，核酸，热原，内毒素等杂质。优点：分离步骤简单；缺点：经几次离心后，才能除去大部分细胞碎片，加工时间长。,蛋白质复性,蛋白质复性,路线2的特点：方法（2）：应用膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但载留细胞碎片和包含体。优点：可进行封闭式操作，不污染环境，也不受环境污染，耗能少。缺点：膜的堵塞和浓度极化常导致可溶性蛋白质的滞留，这项技术问题较多。,蛋白质复性,路线3的特点：方法（3）：所用试剂即可以破菌，又可以溶解包含体。将两道工序合为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合实验室操作。缺点：混有杂质，不易分离。,蛋白质复性,包含体复性的方法 包含体蛋白质的复性是指使包含体内的变性蛋白质恢复其天然三维空间结构从而具有生物学活性的过程.一般分为以下几种方法:1.通过变性-复性的方法获得正确构象和生物活性的重组蛋白.这是一种较通用的方法.,蛋白质复性,包含体复性的方法 将通过细胞破碎,离心分离,多步清洗得到的”纯净”包含体,在强变性剂(58mol/L尿素或58mol/L的盐酸胍)中变性增溶,再将变性蛋白质稀释到适当的复性缓冲液中,或通过对复性缓冲液透洗浓缩,最终得到重折叠的重组蛋白.在溶液中变性-复性方法的关键是优化折叠液和操作步骤,特别是对分子内含多个二硫键的蛋白质更是如此.在此过程中,影响复性蛋白产率的因素有:,蛋白质复性,包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素：(1)复性蛋白的浓度,为防止蛋白质分子间发生聚集,复性蛋白的浓度要尽量稀,一般控制在25-75 ug/mL为好.(2)复性缓冲液要保持适当的氧化还原条件.一般GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比为1为好.(3)复性缓冲液的pH要通过实验来确定最适值.(4)复性溶液中要加入适当的labilizing 试剂,如L精氨酸,可提高复性产率.,蛋白质复性,包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素：(5)复性温度也是一个影响因素,一般在低温下(4-10)进行.(6)为防止聚集发生,复性时,可采取分步加入变性蛋白的操作方法.在溶液中变性-复性方法受各种因素的影响,且对不同蛋白质所需的最适条件可能又不相同,因此对于一个特定重组蛋白的复性要通过实验找出最适条件.,蛋白质复性,包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素：（7）复性辅助因子 变性剂、糖、氨基酸、表面活性剂（8）稀释倍数,蛋白质复性的影响因素,浓度 增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行 温度 蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（40）蛋白质的聚集将十分严重 pH值 通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免 与蛋白的pI值相近 折叠促进剂 L-Arg,PEG,去污剂,尿素和盐酸胍,蛋白质复性,复性操作方法：2.稀释和透析复性稀释法：将溶液稀释，导致变性剂的浓度降低，蛋白质开始复性。透析法：利用透析或电渗析超滤除去变性剂，使蛋白质开始复性。缺点：透析时间长，易形成蛋白质沉淀。,蛋白质复性,蛋白质复性存在问题：蛋白质复性是十分复杂过程，其中目标产品的复性率非常低，一般不超过20%，其原因在于当变性剂稳定后，蛋白质分子可能重新聚合成二聚体，三聚体或多聚体，甚至形成沉淀物。现有提高蛋白质复性收率有：反胶束法复性，单克隆抗体协助复性及保护复性等。,蛋白质复性,红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与 蛋白质浓度对复性的影响,蛋白质复性,红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓度对复性的影响图中有复性区、多聚体区和絮凝沉淀区。降低盐酸胍浓度或增加蛋白质浓度都易使系统进入多聚体区和絮凝区。要减少复性的损失，就必须使操作处于复性界限之上。,蛋白质复性,复性操作方法：3.色谱复性（1）凝胶过滤色谱为代表的非吸附型色谱。（2）吸附型色谱复性，其中常用的金属螯合色谱复性，亲合色谱复性，离子交换色谱复性。,色谱法复性,蛋白质复性,复性操作方法：4.凝胶过滤色谱复性 通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加以分离,从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性.,举例:核糖核酸酶,蛋白质复性,包含体的复性 4.利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性.一般的做法是将1-10mg的蛋白质溶入1-2mL的变性缓冲液中,使蛋白充分变性(一般在室温下数小时或过夜),然后在superdex75 HR10/30或sephacryI S系列柱上进行蛋白质分子重折叠,从凝胶过滤柱上洗脱下来的样品经超滤浓缩回收.利用此法成功地使分子内有9个半胱氨酸,分子量为50000Da的重组人ETS-1蛋白有效地复性,其构象和天然构象相同.,蛋白质复性,包含体的复性 4.利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性.此方法的另一特点是,由多亚基组成的蛋白,变性的亚基可以在凝胶柱上缔合,正确重折叠.对于在凝胶柱上进行重折叠的机理尚不十分清楚,一种可能的解释是在凝胶过滤柱上所进行的重折叠或分子亚基之间的缔合,是在不可逆条件下进行的,因而克服了在溶液中常规重折叠过程中所遇到的主要问题-分子折叠和分子间聚集的动力学竞争.由于在层洗柱上重折叠成天然构象的蛋白质分子的不同流速特性,它们不断地从平衡中被移走,因此有力于变性蛋白质分子的重折叠.,蛋白质复性,复性操作方法：5.亲合色谱复性利用抗原抗体,酶与底物相互作用帮助蛋白质复性也是很有效的一种手段。将抗原或抗体，酶或底物之一固定化在凝胶上，使复性在亲和柱中进行。,各种重组蛋白质复性方法的比较,蛋白质复性,复性效果的检测与评价1.凝胶电泳2.光谱学方法3.色谱学方法4.黏度与浊度5.免疫学方法6.生物学活性及比活性测定,