《蛋白质工程》PPT课件.ppt

蛋白质工程Protein engineering,Protein engineering,蛋白质工程是应用科学，目的是获得有用或有价值的蛋白质。这是一个年轻的学科，目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学学科基础上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域,蛋白质工程进展,蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。福什特（Forsht）等在1985年间对酪氨酰tRNA合成酶的分子改造工作。1987年枯草杆菌蛋白酶改造活力提高10倍。佩里（Perry）1984年溶菌酶分子改造使酶热稳定性提高。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。,蛋白质工程的前景,蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人的前景。例如，科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效型药品。生物材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景。,实际应用,提高蛋白质的稳定性 融合蛋白质蛋白质活性的改变治疗酶的改造嵌合抗体和人缘化抗体,蛋白质工程的研究策略,蛋白质工程的基本途径,蛋白质结构分析 结构、功能的设计和预测创造和改造,两个战略,合理设计 蛋白质计算机设计。使用计算机的方法设计蛋白质是最具挑战性的工作。技术：定点突变定向进化。,蛋白质结构分析,蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。国外有许多研究机构正在致力于研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发 具有高度专一性的药用蛋白质。,结构、功能的设计和预测,根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验直接考察分析结构与功能之间的关系；通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。,计算机辅助蛋白质设计,计算机辅助蛋白质设计（）是指在蛋白质工程中，应用计算机技术，通过对已知的蛋白质顺序、分子构象、结构与功能关系等数据的分机处理，预测和评估蛋白质改造中各种方案，做出最佳选择，具体地讲，是蛋白质工程中蛋白质设计的软件的研究。研究的内容也就是应用软件的开发，包括数据分析处理算法的研究，蛋白质设计模拟模型的建立以及计算机程序编写和软件可用性的研究,Protein design,Protein design is the design of new protein molecules from scratch,or the deliberate design of a new molecule by making calculated variations on a known structure.Protein design requires an understanding of the process by which proteins fold.by use of computer models,Protein design is also referred to as inverse folding.Hence,designing a new protein involves the identification of the sequences which have the chosen structure as free energy minimum.,蛋白质创造和改造,蛋白质的改造，从物理、化学法到基因重组。物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。基因重组技术：如定位突变技术，盒式突变，PCR技术,定向进化Directed evolution,定向进化是一种用在蛋白质工程中的方法利用定向进得到在自然界中未发现发现蛋白质或RNA。,定向进化实验步骤,多样化，Diversification:在此步骤中常用的技术是易错PCR和DNA改组。突变库选择，Selection:理想突变的扫描或选择。扩增，Amplification:确定的突变复制扩增，了解DNA序列的突变。这三个步骤称为一个“回合”定向进化。大多数实验结果将执行一个以上的回合。上一轮的结果供下轮创建一个新库。在实验结束，蛋白质或RNA突变采用生化方法鉴定。,定向进化与自然进化,自然进化,自然进化是环境压力下物种朝着适应生存 环境的方向发展自然进化是漫长时间里通过DNA复制发生突变或通过重组，自然进化是产生了遗传多样性自然进化是自发、非常缓慢、自然选择,定向进化,定向进化在实验室中模仿自然进化定向进化的关键步骤：突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，定向进化有效改造蛋白质，使之适于人类的需要。,定向进化与自然进化的差别,定向进化的一般过程,酶定向进化的意义,酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。,酶分子定向进化的历史,Sol Spiegelman在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行实验，是第一次在分子水平上定向改造单一分子。,RNA噬菌体Q,定向进化的历史,1981年，B.G.Hall等定向改变E.coliK12中ebg酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。1993年，Arnold研究组提出易错PCR的方法。1994年，Stemmer将DNA重组方法引用到酶分子的定向进化中。1999年，Stemmer等把DNA改组延伸到族改组。,定向进化的历史,酶定向进化的过程,酶定向进化通常分3步进行：通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性；导入适当载体后构建突变文库；通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。重复循环，直至得到预期性状的酶。,多样性的产生,定向进化的策略,无性进化 易错PCR、化学诱变剂介导的随机诱变、由致突变菌株产生的随机突变有性进化 DNA改组技术、随机引物体外重组法、交错延伸法,易错PCR(error-prone PCR),一种相对简单、快速廉价的随机突变方法通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。关键是控制DNA的突变频率。此法的不足之处：靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限；中性突变较多；较为耗时、费力；获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。此法突变具有一定的密码偏向性。,易错PCR,连续易错PCR(Sequential error-prone PCR),该方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。,DNA改组技术(DNA shuffling),又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予表达产物以新功能。分子育种,DNA改组原理,1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸延伸22-44步后可获得全DNA片段片段,单个基因的DNA改组,从突变体基因库中分离出的DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随机切割得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组,基因家族改组技术(family shuffling),采用基因家族的改组效果明显高于单个基因的改组效果。特点 改组基因的效率高 提高基因突变机率,基因家族改组,随机引物体外重组法(RPR),交错延伸原理,DNA改组与常规定向进化的比较,基因文库的构建,构建理想的基因文库要考虑的因素：基因文库的质量(1)文库的代表性(2)突变基因片段的序列完整性文库筛选可选择的方法控制突变库的大小与特定的筛选容量相适应,突变体基因的构建策略,DNA随机酶切，片段拼接单链DNA随机拼接（提高不同亲代基因的同源片段重组形成嵌合体基因的效率）限制性酶切片段随机拼接（防止PCR扩增产生相同的亲代基因）,构建突变基因文库的载体系统,噬菌体载体系统基因文库：构建中最早使用插入片段的装载容量大，适合大片段克隆构建出的基因文库质量高、代表性好适合长期保存主要缺点是构建成基因文库后，可采用的文库筛选方法有限,质粒载体系统,质粒载体系统：优点体外操作简便，载体本身的设计上有很大可塑性能实现对基因文库的功能性筛选缺点插入片段的载体容量较小，含有长片段的重组克隆在文库的群体扩增过程中容易丢失转化效率普遍较低不适合文库的长期保存,文库的筛选,建立有效的搜索文库的方法是影响定向进化成功与否的关键采用的定向筛选方法必须灵敏，且应与目的性质相关借助检测仪器易实现高通量筛选,定向进化的筛选,活体筛选法-基于表形观察的筛选 基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库噬菌体显示法；细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面）筛选方法根据各个蛋白质的性质而设，筛选方法根据各个蛋白质的性质而设因此，不具有通用性。突变体基因筛选能否成功的关键是将基因的表型和能通过定量表征的筛选手段紧密联系。为加快分离目的基因的过程，已建立起多种在基因发现上具有“高通量”性能的筛选方法。,高通量筛选技术,突变微生物分离 琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。微球细胞固定法与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。流式细胞计数法:细胞经荧光染色后，通过 高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细 胞计数仪进行测定。,酶活力检测,反应产物：显色pH指示剂显色pH指示剂显色，分光光度计和荧光酶标仪通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测：GC/HPLC，使用较短的柱子以缩短分析时间同位素标记底物：质谱热力学红外检测,噬菌体显示筛选模式,pH指示剂显色高通量筛选,产物显色筛选,荧光产物筛选,基于比色法和荧光检测的高通量筛选,蛋白质工程的应用实例,胰蛋白酶金属硫蛋白人白细胞介素-2组织纤溶酶原激活因子枯草杆菌蛋白酶,组织纤维蛋白溶酶原激活因子,组织纤维蛋白溶酶原激活因子(t-PA)是一种血浆糖蛋白，其功能是将单钥活性形式的血浅纤溶酶原（plg)激活，转变成纤溶酶。溶解血栓，目前进行t-PA蛋白质工程的研究主要是构建长半衰期的t-PA 突变体。通过改变t-PA 分子中的某些糖基化的氨基酸而减少或避免糖基化，可减缓在血浆中被清除的速率，从而获得具有更长半衰期的治疗药剂。,枯草杆菌蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶是重要的工业用酶。朱榴琴等人采用定点突变和随机突变的方法，对枯草杆菌碱性蛋白酶E基因进行改造，突变后的基因插入大肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒中，在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌DBl04 中进行表达，得到突变的碱性蛋白酶，各种突变酶具有抗氧化和增加稳定性的特点，具备了工业用酶的条件。,