《蛋白互作研究方法》PPT课件.ppt
蛋白质相互作用研究方法,王心宇,College of Life Sciences,1 研究蛋白质相互作用的意义 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科蛋白质组学proteomics应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用interactome的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。,2 蛋白质相互作用常用研究方法1 酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)2 pull-down3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4 双分子荧光互补技术(Biomolecular fluorescence complementation,BiFC or Split YFP)5 Far-western analysis,3 酵母双杂交技术3.1 原理,DNA-binding and activating functions in a transcription factor may comprise independent domains of the protein.,The two hybrid technique tests the ability of two proteins to interact by incorporating them into hybrid proteins where one has a DNA-binding domain and the other has a transcription-activating domain.,3.2 酵母双杂交文库构建与筛选BD Matchmaker Library Construction&Screening Kits,诱饵蛋白载体构建,pGADT7-Rec Vector Information,文库构建,Constructing AD fusion libraries by recombination-mediated cloning in yeast.,cDNA library of oilseed rape line RS-1 constructed in yeast,Yeast cells that are mating.A zygote typically has three-lobed shape,the lobes representing the two haploid(parental)cells and the budding diploid cells.,Library screening by mating,Positive clones confirmed on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal,检测特定两个蛋白是否互作,pGADT7 Vector Information,3.3 膜蛋白互作研究方法基于泛素的酵母双杂交体系(mating-based Split ubiquitin system mbSUS“)1）GAL4体系的缺点2)MbSUS 体系,mbSUS 原理,In vivo cloning into mbSUS vectors,GATEWAY cloning method,4 pull down1)原理,2)试剂盒,The MagneGST.Pull-Down System,Figure 1.Overview of the MagneGST.Pull-Down System protocol.P=Prey Protein,M=MagneGST.Particle.,5 免疫共沉淀Co-IP,6 Far-western analysis,双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突变体(YFP,CFP,BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。,7 双分子荧光互补技术 BiFC,Principle of the BiFC assay,GFP的特性 绿色荧光蛋白(GFP)来源于水母(Aequorea victoria)，分子质量约为27 kda，能在各种细胞中表达.受到激发时，不需要任何辅助因子，就能在活体中发出绿色荧光.1992 年，Prasher 等2克隆了GFP 基因.随后，GFP 作为一种研究基因表达和蛋白质定位的活体可遗传标记，在各种类型细胞的研究中得到了广泛的应用.,GFP 的一些定点突变能明显地改变其波长性质.产生的突变体,具有产生多色光的特性，如：GFP66 位的酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyan fluorescence protein，CFP)，203 位的苏氨酸突变为酪氨酸后成黄色荧光蛋白(yellow fluorescence protein，YFP)，145 位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成蓝色荧光蛋白(blue fluorescence protein，BFP)3.2002 年Hu 等1 最先报道了用BiFC技术在活细胞中观察bZIP 和Rel 家族蛋白的相互作用，利用的就是YFP 作标记，在荧光显微镜下用525 nm 波长直接检测黄色荧光.,GFP及其各种突变体的片段互补特性,Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation,Detection of proteinprotein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation,Department of Plant Sciences,Tel Aviv University,Tel Aviv 69978,Israel,Confocal images of bimolecular fluorescence complementation(BiFC)studies,IPG735+PG736,IPG735+PG736,Ppn20-735+PG736,Ppn20-735+PG736,蛋白互作可能导致internalization,多色荧光互补技术,
