《菌种选育》PPT课件.ppt

7 菌种筛选方法,所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的0.050.2。微生物的正突变概率极小，产量提高10以上突变株也只有1/300。,微生物的突变类型多，可分为两大类，第一类为形态突变株，包括菌落形态，菌丝形态，分生孢子形态。另一类是生化突变株，包括抗性突变型，营养缺陷型，条件致死突变型，产量突变等。因此，要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。,在提高筛选品质方面，由于过去对菌体生理了解不够，只能随机筛选（random selection），大量筛选无特定标记的突变株，因此筛选效率不佳；其后由菌株的生理研究，以及由实际研发的经验，发展出合理定向筛选（rational selection）技术。,菌种筛选方案,在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，以多为，主使优良菌种不致于漏网。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，以质和精为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选方案：,第三轮、第四轮(操作同上),初筛和复筛工作可以连续进行多轮，直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。,8 抗性筛选,抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有106频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。,1）一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。,耐高温菌株法筛选：将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。,耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。,2）阶梯性筛选法 药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。,因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。,阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏。阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。,(1)梯度平板法(Gradient plate)先将10ml左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。,梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。,图 吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构,梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌,阶梯性筛选法也有一定的缺点，它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。,(2)纸片扩散法,纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。,9 推理选育(Rational Selection),抗生素产生菌的推理选育是建立在抗生素生物合成机制已知或较清楚的基础上按需要定向选育的一种方法。近几年研究较多，应用较广，成效显著。就一些抗生素而言，经过多年的研究，其代谢机理已较清楚。实践证明，推理选育在抗生素育种上的应用其效果远比传统的随机筛选优越得多，只需适量筛选，即可达到所期望的目的。,替考拉宁产生菌TA2-2组分高含量菌种的推理选育,替考拉宁(teicoplanin)系替考游动放线菌(Acti-noplanesteichomyceticus)发酵产生的一糖肽类抗生素,是5个化学结构十分相似化合物(TA2-1,TA2-2,TA2-3,TA2-4,TA2-5)的混合物。5个组分的差异仅在于酰基侧链的不同。5个组分中TA2-2为主要有效成份。,替考拉宁化学结构,L-缬氨酸是TA2-2组分的酰基侧链的生物合成前体。在L-缬氨酸代谢途径中，L-缬氨酸是该分枝代谢途径的第一个酶乙酰乙酸合酶的反馈抑制剂。因此，如果能够解除反馈抑制，就能增加L-缬氨酸的浓度，有利于TA2-2组分的生物合成。缬氨酸氧肟酸(valinehydroxamate，VH)为L-缬氨酸的结构类似物，如果能够诱变得到缬氨酸氧肟酸的抗性突变株，就有可能选育出TA2-2组分含量高的替考拉宁高产菌株。,替考拉宁推理选育方法：,1 诱变处理：将替考游动放线菌的新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液，吸取5ml于无菌双蝶中，置254nm，功率30W紫外灯下30cm处，振荡照射100s。,替考拉宁推理选育方法：,2菌株对缬氨酸氧肟酸敏感性的考察：将未处理的单孢子悬浮液涂布于含不同浓度的缬氨酸氧肟酸的平板培养基中，培养后观察菌落的生长情况。3 缬氨酸氧肟酸抗性菌株的选育：将诱变后的存活孢子涂布在含0.3%的缬氨酸氧肟酸平板分离培养基中，筛选缬氨酸氧肟酸抗性(VHr)突变株。,表1缬氨酸氧肟酸对产生菌生长的影响,+:极好;+:好;+:中等;+:差;-:不生长,替考拉宁推理选育结果（1）：,替考拉宁推理选育结果（2）：,表2 自然分离株、UV诱变株及VHr拮抗株总产量及TA2-2含量比较,替考拉宁推理选育结果（3）：,表3 菌株98-1-227传代后的生产能力和TA2-2组分含量,Avermectin产生菌诱导推理选育,avermectin(AVM)系一簇十六元大环内酯类抗生素,它含有8个结构相似的组份:A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b。8个组分中B1a为主要有效成份。,Avermectin化学结构,Avermectin结构,每个组份的生物合成途径如下:AVM内酯环由5个乙酸、7个丙酸和1个支链脂肪酸通过1个聚酮体的中间体合成。,Figure Biosynthesis of the avermectin,Comparison of the hypothetical reaction mechanism of SU1 and SU2 on avermectin PKS and milbemycin PKS,Comparison of the hypothetical reaction mechanism of SU10,SU11,and SU12 on avermectin PKS and milbemycin PKS,Avermectin用亮氨酸推理选育方法：,诱变处理将S.avermitilis XC1-25新鲜斜面培养物制成单孢子悬浮液,吸取5ml放入无菌平板中,并置于波长253.7nm、功率30W紫外灯下30cm处开盖、振荡照射60s备用。含有L-Ile平板的制备:将不含L-Ile培养基20ml倒入培养皿内,平放,待凝后再倒入5ml含有0.1%L-Ile的培养基,平放。L-Ile变株的分离:将经UV处理过的存活孢子,以适当浓度涂布于含有0.1%L-Ile的平板培养基上培养,Ile变株系从这种培养基上生长的菌落中分离得到。,Avermectin用亮氨酸推理选育结果：,Tab.1Comparison of AVMB1 productivity among the natural isolates,UV mutants and the I-lei mutants,Structure of the spinosad（多杀菌素）,spinosads的生物合成,多杀菌素生物合成基因簇中各基因的功能,抗性化合物的确定及顺序推理选育,思考题：根据你学的选育知识，设计spinosad的选育？,推理选育步骤,培养基的调整,自然选育,10 培养基的调整,一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。在实际选育中，当选育到一个优良变株时，要改变环境条件，即调整培养基配方和培养条件，使变株处于一个适应的环境中得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，这就是表达型基因型环境的作用。,基于上述道理，对诱变12代后的优良菌株，要进行培养基和培养条件的调整，使它在短时间内的群体遗传结构占优势，从而表现出更高的生产性能，发酵单位达到最佳水平。,表 抗霉素A生产菌在不同环境条件下的生产能力,图 盐霉素生产菌育种过程产量提高情况,C,A,C,B,C,D,E,F,A 营养改良,B 培养基调整,C 选育新菌种,D 菌种改良,E 调整营养，增加种量,F 培养基调整,相对效价,1,600,培养基调整方法：正交设计 响应面方法,首先通过试验确定该菌种最适的碳、氮源、无机盐及其他生长因子，在全面分析影响试验指标的培养基各组成成分的基础上，排除已经明确作用不大的组成成分，让它们作为试验的基础条件，固定在同一水平上，抓住影响指标的限制性因素（组成成分）进行试验，并根据实际可能和菌种的需要，确定各因素的水平组成成分（含量）。,SAS(StatisticalAnalysisSystem)软件是包括数据的统计分析、运筹等问题的科学计算等大量模块的集成软件系统。Packett-Burman(P设计法是基于不完全平衡下的试验方法,用最少试验次数尽可能精确地估计主效果因素。响应面分析法(ResponseSurfaceAnalysis,RSA)是综合试验分析和数学建模最经济合理的实验设计。它以回归法作为函数恒算工具,通过多项式近似,把因子与试验结果(响应值)的关系函数化,以此对因子进行面分析,研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系,弥补了以前在微生物培养基优化方面的不足。,3.3.3 抗噬菌体菌株的选育,在工业微生物发酵过程中，不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。消灭噬菌体 选育抗噬菌体菌株；噬菌体易变异，要不断的选育抗噬菌体菌株。,3.3.3 抗噬菌体菌株的选育,（1）自然选育：以噬菌体为筛子，敏感的菌株不经任何诱变，自然突变获得的抗性菌株。抗性突变频率低。（2）诱变选育：敏感菌株经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经处理后的存活的孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。,3.3.3 抗噬菌体菌株选育的方法,(3)将敏感菌株经诱变因素处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天；再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取出菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。,抗噬菌体菌株的特性试验,（1）抗噬菌体性状的稳定性试验：抗性菌株分别在孢子培养、种子培养、发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。多次传代考察稳定性（2）抗性菌株的产量试验：抗性菌株与原敏感菌株在发酵特性上有所改变，因此，要考察碳源、氮源、通气量等发酵条件对产量的影响。（3）真正抗性与溶源性的区别试验。,检验溶源菌方法：1、将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌相混合，加入琼脂培养基倒平板。2、培养一段时间后，观察长成的菌落是否有透明圈出现。溶源菌长成菌落过程中，由于溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌周围的敏感菌，所以会产生一个个中央有溶源菌的小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。,重层琼脂法1、配制琼脂为1%和2%的宿主培养基。2、取其中琼脂为2%的培养基，倒入平皿，制成底层，凝固后待用。3、再取含噬菌体待测样品0.1ml和宿主的培养液混合，制成一定稀释度，吸取其中的0.1ml加入到盛有34ml1%琼脂培养基（已冷却至4050）的试管中，充分混匀，立即倒入平皿底层的培养基上，制成重层平板。然后置入宿主适宜的温度下培养1620h。4、如果有噬菌体时，在重层琼脂的上层形成透明的噬菌斑。,斑点试验法1、将宿主制成菌悬液，涂布于培养基平板上，45 左右倒置于温箱中一段时间，至平板表面不留水膜为止。2、将不同稀释度的待试样依次用接种环点于平板上，培养数小时之后，根据噬菌斑的形成与否，即可初步判断试样中噬菌体的效价。效价（U/ml）=平均每皿噬菌斑数稀释倍数取样量,