《菌种的选育》PPT课件.ppt

第二章菌种的选育,内 容 1.菌种的来源 2.菌种的选育 3.菌种的保藏,2.1 菌种的来源微生物具有的五大特性1.种类多,分布广;2.比面积大,代谢能力强;3.生长迅速,繁殖快;4.适应性强,容易培养;5.易变异.,生物物质产生菌的筛选微生物-生物产物的来源两个成功因素,1.产生菌的选择;,2.合理的筛选方案,几百倍,选择性,灵敏度,2.1.1.2 待筛选样品的性质,新产物的代谢类型,生产工艺方式,2.1.1.3 筛选方案的设计三种基本的筛选方法：整体生物；2.完整细胞；3.亚细胞制剂,举例1：抗细菌的筛选琼脂扩散法：1.试验菌的制备,金黄色葡萄球菌ATCC6538P,摇瓶培养,调节菌体浓度OD660为0.3,2.琼脂板制备,琼脂培养基,冷却至4550,倒平板,冷却或至4保存,4.琼脂板鉴定,举例2.抗癌筛选 机理 许多天然化疗药物是通过使肿瘤细胞的DNA损伤而治疗的作用。,方法建立：1.噬菌体诱导检测系统：当大肠杆菌溶素原受阻遏状态下的原噬菌体因DNA的损伤而释放出来，通过平板法检测完整噬菌体颗粒的生长情况可作出DNA受损情况判断。,2.生化诱导BIA法,利用一种特别的溶素源，在DNA受到损伤时并不释放出病毒颗粒而是形成-半乳糖苷酶。可以通过检测酶的化学反应加以判断。,分析步骤(BIA),1.指示菌 大肠杆菌BR513(ATCC33313)2.指示微生物培养3.指示微生物倒固体检测平板4.将待测发酵液少量（20ul）涂平板,5.加入-半乳糖苷酶的生色基质混合物（84mg褪蓝RR和14mg6-溴-2萘-D-半乳糖吡喃糖苷于2ml二甲基亚砜中），再加入琼脂静置，观察颜色变化情况。6.结果分析,2.1.2 微生物选择分离的原理和发展,选择分离的五个步骤：1.含有微生物材料的选择2.材料的预处理 3.所需菌种的分离4.菌种的培养 5.菌种的选择和纯化,（1）确定研究目标，了解微生物资源状况；,（2）掌握物种分布，明确采样材料；,研究目标和微生物资源资料确定待选种子的类型。如研究抗菌素，可选择放线菌、真菌、细菌,依照资料或专家介绍，结合自己所掌握的知识及工作经验，明确待选种子在自然界的分布情况，确定采样目标。,（3）根据待选种子的生理学与生态学特性，确定培养基，选择培养条件与方法。,（4）在上述准备工作完成之后，制定具体的筛选方案与操作步骤：,进行综合、具体问题分析来决定。,2.1.2.1 微生物材料的选择,采样时要注意的问题,气候、水分、空气,来源要广,结合产品的特点,标签：地点、时间、气候等,采土地点,铲去表层土515cm,取几十克装入无菌袋中,扎袋，记录时间、地点和环境情况,尽快分离,材料的预处理,如果所需菌种较多可直接分离，如果菌体较少怎么办？,1.物理法：加热、过滤、离心等方法2.化学法：加入一些基质。3.诱饵法:诱饵技术:将固体基质加到待测的土壤或水中,待其菌落长成后在涂平板.,2.1.2.3 所需菌种的分离,为了提高分离效率选择合适的培养基、选择性抑制剂的选择、培养条件控制等等。,采用给混合菌群提供一些有利于所需菌种或不利于其它菌型生长条件以促使所需菌株大量繁殖，从而利于分离它们，所谓的增殖培养。,富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑.,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法.,定向培养的富集方法,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,2.1.2.4 菌种的培养应该注意：各种菌种的培养条件和时间也各不相同。菌落的选择1.铺菌法；2.复印平板法。,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素,2.2 工业化菌种的要求,1.能够利用廉价的原料，或使用来源丰富的原料.,2.菌体温度应适应较高的温度.,3.遗传性能要相对稳定,4.菌对所采用的设备和生产过程的适应性,7.产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,5.菌的产物得率和产物在培养基中的浓度,6.产物容易从发酵液（细胞）中提取,2.3 施加选择压力的分离方法1.富集液体培养法:连续培养菌种的筛选比生长速率(u):每克菌体每小时增长的菌体量.u=1/XdX/dt.,比生长速率u,基质浓度,B,A,r,限制性基质,培养液,当进行流加时基质浓度r时,B菌先被洗出;,2.固体培养基的使用主要适用于初级代谢产物菌株的筛选,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）,文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌,采样（造纸厂）,80度30分钟处理,0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落,从285个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,2.4 随机分离方法1.抗生素产生菌筛选2.药理活性化合物的筛选3.生长因子产生菌的筛选4.多糖生产菌的筛选,2.4 菌种选育目的:,防止菌种退化解决生产实际问题提高生产能力提高产品质量开发新产品,自然选育自然选育:在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种的筛选的过程.,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,自然选育在工业生产上的意义,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变,自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验,2.4.2 诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理：紫外，快中子,化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,生物诱变剂 噬菌体,2.4.2.1 诱变育种的一般步骤见(p38)整个流程主要包括:诱变和筛选.诱变育种中的几个注意问题1.出发菌株的选择 出发菌株标准:产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。,待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长,这样有利于变异率提高得到很好的重现性。,2.复合诱变因素的使用出发菌株通常有三种:从自然界分离得到的野生型;通过生产选育的菌株即自发突变选育已经通过诱变选育的菌株.对于不同出发菌株考虑采用不同的诱变剂进行处理,3.剂量的选择 变异率与致死率有一定的关系,利用致死率作为剂量选择的依据.4.变异菌株的筛选初筛:总结变异的菌落“形态”特性和产量之间的关系.,根据平皿反应直接挑取高产菌株:平皿反应:每个菌落产生的代谢产物与培养基的指示物作用后的变色圈和抑制圈等等.常用方法:纸片培养显色法、透明圈法、琼脂片法、浓度梯度法等等。,以上为产量型的筛选营养缺陷型的筛选：经过诱变后，经过中间培养，淘汰野生型、检出营养缺陷型确定生长谱。淘汰野生型的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等，其目的是浓缩营养缺陷型。营养缺陷型检查方法：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法等等。,5.高产菌株的获得与筛选条件的配合 出发菌株、诱变因素、筛选条件,2.4.3 物理、化学诱变剂的使用原理方法1.紫外线：有效波长260nm左右；诱变条件，一般选择15W紫外灯，距菌（孢子）悬液30cm左右，在黑暗或红灯照射环境下进行。作用机制：形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡。,2.快中子 快中子的生物学效应是由其撞击原子核后产生的质子产生的。能够引起较多的点突变和染色体变，而产生诱变育种的效应。,3.氮芥(p40)机理：氮芥的盐酸盐和碳酸氢钠反应释放出氮芥子气，再与细胞作用引起染色体发生畸变。使用方法：活化剂和解毒剂的配置氮芥的盐酸盐配置诱变作用诱变终止,4.亚硝酸 作用机制：脱去碱基中的氨基，引起碱基对的转换作用从而造成突变。5.N-甲基-N/-亚基胍（NTG)对DNA起到烷化剂和亚硝酸的作用。6.航天育种利用空间高真空、微重力和强辐射的特点,2.5 抗噬菌体菌株的筛选 证明抗噬菌体突变在发生与噬菌体接触之前的经典实验：波动实验、涂布实验、影印实验。2.5.1 抗噬菌体菌株选育方法：自然突变；2.诱发突变。2.5.2 抗噬菌体的特性实验,1.抗噬菌体性状的稳定性实验 点滴法、双层琼脂法。2.抗性菌株的产量实验3.真正抗性和溶原性的区别,2.5.3 噬菌体的防治 噬菌体的危害：引起发酵液变稀,引起菌丝体变形,消解,发酵终产物积累停止甚至下降.怎样防治?1.正确判断2.普及有关噬菌体的知识3.选育抗噬菌体菌株4.消灭噬菌体5.收集和保存噬菌体,2.6杂交育种杂交育种:将两个基因型不同的菌株经吻合(接合)使遗传物质重新组合,从中分离和筛选具有遗传新性状的菌株.,杂交育种的目的1.改变遗传物质基础,获得杂种菌株;2.获得优良菌种,克服由于长期诱变造成的菌株生活能力下降等缺陷;3.扩大变异范围,改变产品质量和产量,甚至出现新的品种;4.促进遗传学理论发展.,营养缺陷性:微生物经诱变剂处理,由于基因突变,失去了合成某种物质的能力,不能在基本培养基上生长需要补加一定种类的有机物质后才能生长.,2.6.1 细菌的杂交育种,A-B+Lac-SMrT1s,A+B-Lac+SMsT1r,A-B+Lac-SMrT1s,A+B-Lac+SMsT1r,A+B+Lac+SMsT1r,A-B-Lac+SMsT1r,A+B+Lac+SMrT1s,A+B+Lac+SMsT1s,A+B+Lac+SMrT1r,等等组合型,细菌的杂交育种其他方式：F因子的转移、转化和转导等发生基因重组的方式。例如：F因子的转移：（Hfr),F+,Hfr,+,放线菌的杂交育种,链霉菌基因重组主要过程,亲本,亲本,混合菌丝体,异核体,亲本分离子,部分合子,异核系,重组体,基因重组过程中的四种遗传体系:1.异核体:在同一菌丝或菌体中存在不同基因型的细胞核.,2.接合现象,供体染色体片段和受体染色体相结合形成了部分合子又称半合子,3.异核系的形成 当部分合子形成后，就会形成杂合的无性繁殖系。产生的孢子多为单倍体。如果没有发生染色体的重组不能在基本培养基上生长。,分生孢子,4.重组体的形成 异核体菌落在生长过程中，染色体重叠的两节段（二体区）的不同位置发生交换后能 产生重组体孢子。,+,重组体,放线菌的杂交技术1.混合培养法a.选择性平板法b.异核系分析法,2.平板杂交法,3.玻璃纸转移法,成功报道：金霉素、土霉素、新霉素、红霉素、新霉素等抗生素杂交育种方面。,2.6.3 霉菌的杂交育种准性生殖过程形成异核体杂合双倍体的形成（核融合或核配）体细胞重组（体细胞交换、分离和单倍体化）,2.6.3.2霉菌杂交技术1.选择直接亲本,突变菌株（遗传标记）,诱变,原始亲本,杂交,直接亲本,遗传标记的多样性：营养突变型、抗药性突变型、形态突变型等。,遗传标记要求：菌体形态稳定能在基本培养基上形成丰富的孢子不影响产量在配对过程中容易形成异核体,2.异核体的形成（强制异合）方法：完全培养基液体混合法、完全培养基等方法（见P47).3.双倍体的检出。4.分离子的检出,原生质体融合技术原生质融合:把亲本的细胞壁在酶的作用下瓦解,形成原生质体.两个原生质体在高渗环境条件下,在助融剂的作用下,发生细胞融合,基因组通过接触到交换,从而实现遗传重组.,标记菌株筛选,原生质体制备,融合,再生,融合子选择,实用菌株筛选,原生质融合的优点1.诱变、遗传转化、原生质体融合效率高;2.能够得到多种类型的重组子;3.重组频率高4.可以和其他育种技术相结合5.便于提高筛选效率,原生质体融合技术的应用原生质体制备和再生过程引起产量突变。原生质体制备和再生过程引起质粒丢失。种内融合引起抗生素合成中限速酶得到修饰种间融合可能引起“沉默基因”的表达。,2.7 DNA重组技术DNA重组技术：按照人的意志，将某一（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。开辟了一个分子育种的新领域-分子育种,分子育种：利用基因工程技术、原理和设备，在分子水平上改良菌种。2.7.1 优越性：1.增加生物合成基因量而增加抗生素的产量；2.导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量；3.两种不同基因在体外重组后再导入受体内可以合成杂交抗生素；4.激活沉默基因5.把异源基因克隆到宿主中表达，以期彻底改变生产工艺。,2.7.2 DNA重组技术的基本过程1.目的基因的取得有三种途径：从供体中直接提取通过反转录取得cDNA化学合成特定功能的目的基因,2.优良载体的选择具有一个自我复制能力的复制子能在受体细胞内大量繁殖；最好只有一个限制性内切核酸酶的切口；必须有一种选择性遗传标记,3.目的基因与载体DNA的体外重组采用限制性酶切或人为地在DNA的3端接上polyA和polyT可以使重组的两个DNA分子产生“卯眼”似的粘性末端。然后两者在56下“退火”形成新的双链，在连接酶的作用下形成重组载体,4.重组体导入受体细胞5.重组受体细胞的筛选和鉴定,筛选类别,遗传学直接筛选法：抗药性、噬菌斑形成能力等,分子生物学间接法：酶切相对分子量的大小、分子杂交等,举例抗药性变化检测：,质粒,Apr,Tcr,Apr,+,含氨卞青霉素培养基,含四环素培养基,6.工程菌的大规模培养,基因工程菌不稳定具体表现质粒的丢失重组质粒发生DNA片段脱落表达产物不稳定,解决不稳定性对策组建适当载体(质粒上插入 特殊DNA片段)选择适当宿主施加选择压力（抗生素添加法、抗生素依赖变异法、营养缺陷型法）控制基因过量表达控制培养条件改良质粒固定化工程菌,2.8 菌种的保藏2.8.1 意义：菌种保藏首先是菌种不死亡，保持优良的生产性状。菌种保藏的原理和方法原理：根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少变异。,菌种保藏的几种方法：1.斜面冰箱保藏法；2.沙土管保藏法；3.菌丝速冻法；4.石蜡油封存法；5.真空冷冻干燥保藏法6.液氮超低温保存法,作业通过查阅资料请你设计一套从自然界筛选构建高产纤维素菌株的方法.要求:1.,