《药敏与耐药》PPT课件.ppt

药敏与耐药,-铜绿耐替加,进修医师：李思敏 指导老师：欧好,铜绿假单胞菌-替加环素敏感！敏感？,疑问：,1、为什么天然耐药的药物会检测出敏感？2、铜绿假单胞菌敏感的标准是什么？3、为什么铜绿对替加环素天然耐药？4、有什么因素可以影响这个结果？这个结果可信吗？,目录,什么是细菌培养,细菌培养：细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术。细菌在自然界中分布极广，数量大，种类多，它可以造福人类，也可以成为致病的原因。大多数细菌可用人工方法培养，即将其接种于培养基上，使其生长繁殖。培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用。细菌培养是一个复杂的技术。,细菌培养仪器,药敏试验方法-抑菌圈,在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。,抑菌圈,结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据NCCLS标准，作出“敏感”、“耐药”和“中介”的判断。,几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度,药敏试验方法：MIC,MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是1824小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。本院细菌实验室采用的药敏方法就是：MIC（仪器自动分析）,MIC测定,不同的药敏试验方法，针对不同药物，可靠性不一样。所以对不同的细菌、药物都有明确标准及培养基质控标准。,铜绿假单胞菌的抑菌圈和MIC标准,铜绿假单胞菌 抑菌圈直径及 MIC 解释标准,没有四环素（包括替加环素类），余抗生素MIC最高的标准是=2ug/ml来源于：CLSI抗微生物药物敏感性试验的执行标准,质控范围,质控菌株在质控范围内来确定培养基质量,目录,耐药性,又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。,细菌主要通过以下5种方式对抗菌药物产生耐药：,（1）产生灭活酶或钝化酶，将抗菌药物转化为无活性的代谢物；（2）改变靶位结构，使抗菌药物可作用靶位的数量减少；（3）降低细胞膜的通透性，减少抗菌药物的进入；（4）产生生物被膜，抵御抗菌药物的杀伤；（5）当药物进入细胞后，以上这些屏障并不能阻止抗菌药物产生毒性作用，所以有效地向细胞外泵出药物是细菌对抗菌药物产生耐药的重要方式,天然耐药,膜微孔蛋白缺失,钝化酶的产生,主动外排泵,铜绿假单胞菌天然耐药的机制,替加环素,铜绿其他的耐药机制,还有一些机制：基因原件的转移 耐药基因的突变-酰胺酶 膜通透性的减低 生物膜形成,获得性耐药,适应性耐药,目录,铜绿-替加,铜绿假单胞菌对替加环素天然耐药，其细胞膜上的主动外排系统是重要因素。根据全基因组序列分析，推测铜绿假单胞菌至少有12种主动外排泵，到目前为止已发现了7种，其中MexXY外排泵在铜绿假单胞菌对替加环素产生耐药的过程中起关键作用。MexXY外排泵在野生株和耐药株中均存在，可介导铜绿假单胞菌的天然耐药与获得性耐药。MexXY外排泵除了导致铜绿假单胞菌对替加环素耐药，尚可引起其对氨基糖苷类药、红霉素和氟喹诺酮类药耐药，外排泵中的任一组分失活都将导致铜绿假单胞菌对抗菌药物的敏感性大大提高。MexXY外排泵中，MexY是内膜转运蛋白，MexX是膜融合蛋白。MexXY 的 2 种蛋白由操纵子 mexXY 所编码，mexXY操纵子缺失外膜蛋白基因，MexXY可利用其他外排泵的外膜蛋白作为自己的外膜蛋白。mexZ是MexAB外排泵的调节基因，位于mexXY基因上游，转录方向与mexXY基因相反；其转录产物MexZ蛋白为阻遏蛋白，可抑制mexXY基因的表达。当其突变时，可导致阻遏功能被抑制，使得mexXY基因表达增强，从而导致细菌耐药。,替加-铜绿,替加环素是首个用于临床的甘氨酞环素类抗菌药物，不受四环素类两大耐药机制(核糖体保护和外排机制)的影响，对革兰阴性菌、革兰阳性菌及厌氧性细菌均有非常高的活性。多个回顾性分析，显示替加环素对多重耐药革兰阳性菌及阴性菌均有较好的体外药敏活性(除外铜绿假单胞菌)，对革兰阳性球菌的抗菌活性最强。铜绿假单胞菌对替加环素MIC50/90均为8ug/ml另有研究提示替加环素对铜绿假单胞菌MIC90为32ug/ml。,铜绿外排系统的表达,外排MexAB-OprM、MexXY-OprM在野生菌中即有低表达主动外排系统在多重耐药铜绿假单胞菌中普遍高表达，并且有多重表达铜绿主动外排泵系统有基因变异的现象，那么我们可设想其存在低表达和不表达的变异，目前有研究者在抗生素的进一步研究中提到抑制细菌外排泵的表达,疑问：,1、为什么天然耐药的药物会检测出敏感？2、铜绿假单胞菌敏感的标准是什么？3、为什么铜绿对替加环素天然耐药？4、有什么因素可以影响这个结果？这个结果可信吗？,病历报告分析,目前没有替加环素对铜绿药敏鉴别的相关标准。据我们所得的报告，提示MIC=0.5，虽然无相关标准，与既往相关替加对铜绿的MIC的报道不相符，且据浓度提示确实达到敏感。如果对铜绿假单胞菌的判断是正确的，那么这株铜绿有可能是变异株对可疑变异株，可考虑传代后再培养及药敏有些报告可能提到敏感只代表体外活性，体内抗生素不一定有效，但这一项主要是针对适应性耐药、获得性耐药。是否对天然耐药有影响并不清楚该患者两次培养为同一菌群，同一药敏结果，是否为变异株，需等候检验科老师进一步定论,是否还存在其他原因及机制还需要有兴趣的同道进一步查询。,谢谢聆听！,铜绿的外排系统可能有低表达,多重药物排除系统可能牵涉到细胞膜的流通性,不仅仅是作为回应环境的压力,更是在细菌自然生长时处理可能发生的细胞膜损伤.当绿脓杆菌面对外来添加许多用来损坏细胞的试剂时,会通过细胞膜上的外排系统将有害物质送出,以降低这些物质对病原菌的伤害,而此系统的基因会就会相应的被大量表现出来面对这种环境压力.谷胱甘肽(G S H)是细胞内最重要的抗氧化剂,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽,半胱氨酸上的巯基为其活性基团,具有重要的抗氧化作用和整合解毒作用.当细胞内生成少量 H 2 O 2 时,G S H 在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下,把 H 2 O 2 还原成 H 2 O,其自身被氧化为氧化性谷胱甘肽(G S S G),G S S G在的谷胱甘肽还原酶催作用下,接受 H还原成 G S H,从而使体内自由基的清除反应能够持续进行 10.因此谷胱甘肽作为细胞内抗氧化作用的第一道防线,对于保护细胞免受氧化压力的损伤起着至关重要的作用.我们猜测还原性谷胱甘肽在氧化压力下转变成氧化性谷胱甘肽可能是一种信号,促使外排系统表达.当细胞内缺失谷胱甘肽时,这种信号中断,引起 M e x X Y 的低表达,膜微孔蛋白缺失,铜绿假单胞菌产生几种和天然耐药有关的蛋白通道，主要的通道是 OPrF，大多数分子能穿过 OprF，但实际上并不是很多分子穿过 OprF 通道。有文献显示，缺失 OprF 通道并没有使细菌不产生耐药。铜绿假单胞菌上的特殊通道还包括:OprB(糖蛋白特殊通道)、OprP(磷酸盐特殊通道)、OprO(多聚磷酸盐特殊通道)、OprD(带正电荷的氨基酸特殊通道)。目前已经清楚，亚胺培南和其他碳青霉烯类通过孔蛋白 OprD 穿过细胞膜，而其他 内酰胺类不能利用 OprD，蛋白的缺失增加了碳青霉烯类的耐药性,钝化酶产生,主要包括 内酰胺酶及氨基糖甙类钝化酶，大多数酶是铜绿假单胞菌由质粒编码从外界获得的。内酰胺酶主要包括 AmpC 酶、超广谱 内酰胺酶(ESBLs)及金属酶(MBL)，AmpC是一种由染色体编码的钝化酶，其编码 内酰胺酶，内酰胺酶能够破坏 内酰胺环，从而使 内酰胺类抗生素丧失结合位点。AmpC 酶的产生使铜绿假单胞菌对除碳青霉烯类以外的所有 内酰胺类产生耐药。氨基糖苷类钝化酶能导致药物不易进入菌体内，也不易与细菌内靶位(核糖体 30s 亚基)结合，从而失去抑制蛋白质合成的能力,主动外排泵 就是拥有将药物泵出细胞的外排泵。铜绿假单胞菌外排泵是一种质子泵，可将多种药物泵出细胞并参与生物被膜形成，从而产生多重耐药这些外排泵引起铜绿假单胞菌对大环内酯类、内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素耐药，只有多黏菌素类药物不能通过外排泵泵出体外。MexXY-OprM 是近来研究最多的一类多重主动外排泵系统，它除了能泵出喹诺酮类药物，还能泵出氨基糖甙类、四环素类药物。在临床分离的耐药株中，已发现主动外排机制与型拓扑异构酶突变共同存在，而多种耐药机制在同一菌株中同时存在，容易产生菌株对药物的高耐药性。,获得性耐药,当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。目前认为后一种方式是产生耐药菌的主要原因。为了保持抗生素的有效性，应重视其合理使用,药敏试验折点的建立,1.MIC的分布2.药代动力学和药效学 定 MIC的折点3.临床疗效和细菌清除率4.抑菌圈直径的分布 定抑菌圈折点统计学的线性回归计算错误率：尽可能减少极重要误差(假敏感率),药敏试验的错误来源,体内、体外试验的不一致性某些菌测某些药，结果有误头孢菌素、氨基糖甙类：沙门菌、志贺菌头孢菌素：李斯特菌属头孢菌素、氨基糖、克林、TMP/SMZ：肠球菌Beta内酰胺类：MRS即使敏感，也应报告耐药某些细菌对某些抗生素天然耐药则不需要做药敏试验,替加环素判定标准分析替加环素是首个用于临床的甘氨酞环素类抗菌药物，目前CLSI尚无替加环素的药敏结果判定标准，美国FDA和欧洲EUCAST中的替加环素折点有所差异，差别主要在于革兰阴性杆菌。本研究采用FDA及EUCAST标准分别检测2264株临床多重耐药革兰阴性菌及革兰阳性菌对替加环素的体外药敏活性，分析不同判定标准下替加环素的药敏结果。对于革兰阳性球菌，FDA及EUCAST敏感折点相同，两种判定标准下MRSA,MRSCN替加环素敏感率相同。对于革兰阴性杆菌，FDA及EUCAST折点相差1个稀释度，采用EUCAST折点后，革兰阴性菌敏感率下降，其中大肠埃希菌敏感率变化最小，敏感率仍保持在98%以上;而肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌敏感率变化较大，肺炎克雷伯敏感率下降了18.8%，鲍曼不动杆菌敏感率则下降了33.3%o Zarkotou等(8J采用微量肉汤稀释法检测部分革兰阴性菌对替加环素体外活性，结果显示，采用EUCAST判定折点后肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌菌株对替加环素敏感率分别下降了20.0%,Alterations of OprD in carbapenem-intermediate and-susceptible strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from patients with bacteremia in a Spanish multicenter study,We investigated the presence of OprD mutations in 60 strains of metallo-lactamase-negative Pseudomonas aeruginosa intermediately susceptible(IS n=12;MIC=8 g/ml)or susceptible(S n=48;MICs 1 to 4 g/ml)to imipenem and/or meropenem that were isolated from patients with bacteremia in order to evaluate their impact on carbapenem susceptibility profiles.The presence of mutations in oprD was detected by sequencing analysis.OprD expression was assessed by both outer membrane protein(OMP)analysis and real-time PCR(RT-PCR).Fourteen(23%)isolates had an OprD identical to that of PAO1,and OprD modifications were detected in 46 isolates(77%).Isolates were classified as OprD full-length types(T1 n=40,including both wild-type OprD and variants showing several polymorphisms)and OprD deficient types(T2 n=3 for OprD frameshift mutations and T3 n=17 for premature stop codons in oprD).RT-PCR showed that 5 OprD type T1 isolates presented reduced transcription of oprD(0.1-to 0.4-fold compared to PAO1),while oprD levels increased more than 2-fold over that seen with PAO1 in 4 OprD type T1 isolates.A total of 50%of the isolates belonging to OprD deficient types were susceptible to both carbapenems,and 40%were susceptible to meropenem and intermediately susceptible to imipenem.Only one isolate(5%)within this group was intermediately susceptible to both carbapenems,and one(5%)was susceptible to imipenem and intermediately susceptible to meropenem.We concluded that OprD inactivating mutations in clinical isolates of P.aeruginosa are not restricted only to carbapenem-resistant isolates but are also found in isolates with imipenem or meropenem MICs of only 0.06 to 4 g/ml.,外排泵、在野生株中即有低度表达，并导致其对多种抗生素的固有耐药和获得性耐药。表达的轻微升高就可提高耐药水平，可引起对美罗培南、氨曲南等 内酰胺类、氟喹诺酮类抗菌药物、四环素类和 内酰胺酶抑制剂的耐药。是近来研究最多的一类多重耐药主动外排系统，可介导铜绿假单胞菌的固有耐药和获得性耐药。外排泵高度表达可引起对氨基糖苷类抗生素、红霉素和氟喹诺酮类药物耐药。,替加环素的作用机制与四环素类抗生素相似，都是通过与细菌30S核糖体结合，阻止转移RNA的进入，使得氨基酸无法结合成肽链，最终起到阻断细菌蛋白质合成，限制细菌生长的作用。但替加环素与核糖体的结合能力是其它四环素类药物的5倍。说明本品抗细菌耐药性的能力优于其它四环素类药物。替加环素的抗菌谱包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和厌氧菌，体外实验和临床试验显示，替加环素对部分需氧革兰氏阴性菌（如弗氏枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌和肺炎克雷伯氏菌、鲍曼氏不动杆菌、嗜水气单胞菌、克氏枸橼酸杆菌、产气肠杆菌、出血败血性巴斯德菌、粘质沙雷菌和嗜麦芽寡养单胞菌等）敏感。铜绿假单胞菌对替加环素耐药。,采用Vitek-2 compact配套药敏卡片进行体外药敏试验，操作和药敏解释标准按照美国临床实验室标准化研究院(CLSI)2010年版12j进行。替加环素分别采用美国FDA标准及欧洲EUCAST标准，FDA和EUCAST对革兰阳性球菌的敏感折点相同:葡萄球菌属(0.5p,g/ml为耐药)，肠球菌属(_0.5.g/ml为耐药);对于革兰阴性菌有所不同，FDA标准:肠杆菌科及不动杆菌属C _2 lxg/ml为敏感，8 I留ml为耐药)，EUCAST折点:肠杆菌科及不动杆菌属(l N留ml为敏感，2g1m1为中介，2!创为耐药)，铜绿假单胞菌无折点IIl0,替加环素,替加环素属于新一类抗生素，是已知甘氨酰环素类抗生素的一个新类。甘氨酰环素类抗生素制剂是美满霉素（米诺环素）的衍生物。四环素类药物的作用机制是，与30S核糖体A位结合，阻止氨基酸转运RNA进入核糖体，从而阻止了氨基酸残基形成肽链。甘氨酰环素类与四环素类作用机制相似，但其亲和力比后者强。甘氨酰环素类与核糖体A位的另一个区域直接相互作用。替加环素抑制肽链形成，影响细菌结构形成及一些功能实现，从而杀灭细菌或抑制细菌繁殖。,天然耐药机制铜绿假单胞菌难以被清除的重要原因是其天然耐药，铜绿假单胞菌拥有 5 567 个基因编码6 26Mbp 碱基对，相比之下，流感嗜血杆菌只有1 714个基因编码 1 83 Mbp 碱基对，而细菌只需1 500个基因即可保证生长与繁殖，如此庞大的基因库，使得铜绿假单胞菌获得很强的天然耐药能力。天然耐药机制主要包括膜孔蛋白缺失、主动外排泵及钝化酶的产生。这些天然耐药机制使铜绿假单胞菌的基础MIC 值增加，使许多抗生素无效,影响药敏结果的因素,一、培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。二、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。三、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。四、培养时间：一般培养温度和时间为37 8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4冰箱内24小时，使抗菌药预扩散，然后再放37温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。,多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，69毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。,