《色谱分析方法》PPT课件.ppt

色 谱 分 析 方 法,一、色谱分析法概述,色谱分析法已成为当代科技迅速发展时期的最适宜的最重要的分离分析方法，形成了一门新兴学科色谱法。气相色谱、液相色谱、凝胶渗透色谱、离子色谱等都得到了广泛深入的应用。,色谱法的独到之处在于它的高分离效能，实质是讨论谱峰间的距离和谱峰的宽窄，即所谓色谱柱的高效性和高选择性。这两个性能指标的理论本质，是由组分在两相中分配系数不同的热力学过程和组分在两相中扩散速度不同的动力学过程所决定的。,因此，要达到多组分复杂混合物通过色谱柱理想地分离，就必须从热力学和动力学两个方面进行综合性地研究；同时对难分离物质要选择最佳色谱分离条件，以达到快速分离的目的。,1、色谱方法的分类,随着色谱理论的不断完善和色谱技术的进步，其分类方法众多，常见的如下：,用气体作为流动相,气相色谱法Gas chromatography(GC),液相色谱法Liquid chromatography(LC),用液体作为流动相,A、按两相状态分类：以流动相状态为准划分方法类型,等十余种方法。,B、按样品组分在两相间分离机理分类:利用组分在流动相和固定相之间的分离原理不同而命名的分类方法。,吸附色谱法,分配色谱法,离子交换色谱法,凝胶渗透色谱法,离子色谱法,超临界流体色谱法,2、色谱技术问题,色谱技术有如下几方面：,进样技术，特别是关于毛细管色谱的进样技术；色谱柱制备技术；固定相和流动相的选择技术；多维色谱系统组合切换技术；流出组分检测技术；程序升温技术和剃度洗脱技术等。,这些技术都在实践中得到了广泛应用和继续提高，是色谱工作的一个重要方面。,3、色谱仪器,色谱仪器是验证色谱理论和色谱技术应用的重要手段，也是建立各种分析方法的必须条件。上世纪90年代以来，色谱仪器的多样化、高精化、智能化等程度日新月异。著名的色谱仪器厂家有：美国的安捷伦公司、日本的岛津公司、waters公司等，国内的上海、大连等公司也生产了质量较高的色谱仪。,4、色谱法的应用,由于色谱法独具特点，使它在各领域中获得广泛的应用。,石油化学,环境科学和环境保护,生物学、微生物化学、生命科学,食品工业、农林牧渔业,医学及医药学,商品检验,应用领域,二、色谱法的本质及流程,1、色谱法的本质色谱法的本质在于色谱柱高选择性和高效能的分离作用与高检测技术的结合。,混合组分的样品在色谱柱中分离的依据是：同一时刻进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复多次（103106）地分配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组分，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在色谱柱中的移动速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来，最后按顺序流出色谱柱而进入信号检测器，在色谱数据机上显示出各组分的色谱行为和谱峰数值。,2、色谱方法的装置系统流程色谱方法装置流程图见下图,5-记录仪,二、色谱法的本质及流程,1-流动相及控制装置；,2-流动相净化器,3-色谱柱,4-检测器,三、色谱分析法的一般特点,1、高选择性色谱分析方法对那些性质极为相似的物质，如同位素、同系物和烃类异构体等有良好的分离效果。这种选择分离，主要采用高选择性固定液，使各组分间的分配系数能产生较大的差别而实现保留值不同。,2、高效能 色谱分析法对那些沸点极为相近的多组分混合物和极其复杂的多组分混合物，有能力改善它们的峰形，使各组分彼此间有良好的分离效能。这种高效能作用,主要是通过色谱柱具有足够的理论塔板数（填充柱为几千块/m，毛细管柱可达105106块/m）来实现的。,3、高灵敏性色谱分析法的高灵敏度检测信号，表现在检测器方面。目前在色谱界已出现几十种检测器，可检测出10111013g的物质量。因此在痕量分析中可大显功效。如超纯气体、高纯试剂中的ppmppb级的痕量杂质测定，测定大气污染物中的ppbppt级的痕量毒物；测定农、副产品、水果、食品中的ppmppb级的农药残留物。,4、分析速度快 色谱分析法，特别是气相色谱法，分析速度较快。一般较为复杂的样品可在几分钟到几十分钟内完成。而且现在的色谱仪器多数已实现自动化、计算机化，配以高速分离的色谱系统，分析速度会更快。,5、GC与LC特点之比较 两种色谱法的根本区别在于流动相状态。气相色谱法多由永久性气体作流动相，由于载气相对分子质量低，分子间空隙大，故粘度低，流动性好，组分在气相中运输速度快，流动相渗透性强，因此可以增加柱长，提高色谱柱理论塔板数，从而增加柱效；,气体作流动相价格较液体的有机溶剂低廉；气相色谱法可以选择愈来愈多的合成新固定液；气相色谱法分析的对象多为相对分子质量M1000、低沸点、易挥发、热稳定性较好的化合物，而且，样品必须在柱前变成气态分子，否则不能随载气运输分离。对于大分子、难挥发、热稳定性差的化合物较为困难。裂解气相色谱法可以对高分子化合物进行裂解后分离分析。,液相色谱法采用液体作流动相。适于作液相色谱的流动相较仅有几种惰性气体的GC流动相多；流动相对样品组分有较好的溶解作用，且参与溶质的分配，可增大分离的选择性。液相色谱适于分析高沸点、难挥发、热稳定性差的、分子量（M10002000）较大的液体化合物，样品可直接进样，一般不需作样品衍生化处理。,选择好流动相是改善液相色谱分离的关键之一（液体种类繁多，选用二元或三元流动相时同时洗脱，改变载液的种类浓度、比例、极性、PH稳定等，则可以提高LC的分离度）；流动相因为是液体，所以密度较高，组分扩散系数（DL）低（大约占气体的105），故LC分析速度慢；液体粘度大于气体100多倍，传质也较慢，故采用小颗粒，窄分布固定相和高压泵强制流动相通过色谱柱以获得高效率分离；高效液相色谱有其独特的检测器，如紫外检测器、示差检测器、荧关检测器等，它们都有高的灵敏度；高效液相色谱可进行大组分量制备，收集柱流出组分十分方便。,四、色谱基本理论,1、色谱图色谱图是色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或载气流出体积的曲线图。色谱图是色谱基本参数的源流，可根据色谱图中峰位置点进行定性，根据峰高或峰面积进行定量；根据各峰不同的位置及其峰宽变化状态，可对色谱柱的分离性能进行评价，表征色谱操作条件的优劣。,2、色谱图相关名词（色谱）峰（Chromatographic）Peak色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。峰底Peak base 峰的起点与终点之间连接的直线（见图3中的CD）。峰高（h）Peak Height从峰最大值到峰底的距离（见图3中的BE）。峰宽（W）Peak Width在峰两侧拐点处作切线与峰底相交两点之间的距离（见图3中的KL）。,色谱流出曲线图,半高峰宽（Wh/2）Peak Width at half height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（见图3中的HJ）。峰面积（A）Peak area 峰与峰底之间的面积（见图3中的CHEJDC）。标准偏差（）Standard error 0.607倍峰高处所对应峰宽之一半。,拖尾峰Tailing Peak后沿较前沿平缓的不对称的峰。前伸峰leading Peak前沿较后沿平缓的不对称的峰。假峰Ghost Paek并非由试样所产生的峰。畸形峰 Distorted Peak形状不对称的峰，如脱尾峰、前伸峰。,基线Baseline 在正常操作条件下，仅有载气通过检测器系统时所产生的响应信号的曲线。基线漂移Baseline drift基线随时间定向的缓慢变化。基线噪声（N）Baseline noise由各种因素所引起的基线波动。,三、色谱基本参数,1、死时间（tM）Dead time不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大值所需的时间（见图3中的tM）。2、保留时间（tR）Retention time组分从进样到出现峰最大值所需的时间（见图3中的tR）调整保留时间（tR）Adjusted retention time减去死时间的保留时间（见图3中的tR）tRtR.tM3、死体积（VM）Dead Volume不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的载气体积。,4、保留体积（VR）Retention Volume组分从进样到出现峰最大值所需的载气体积。VR=tR.FC FC载气流速（ml/min）。5、柱效能Colume efficiency色谱柱在色谱分离过程中主要由动力学因素（操作参数）所决定的分离效能。通常用理论板高或有效板数表示。、理论板数（n）Number of theoretical plate表示柱效能的物理量，可由下式计算n=5.54(tR/W)2=16()2、理论板高（H）Height equivalent to a theoretical plate单位理论板的长度。H=L/n 有效板数（neff）Number of effective plate减去死时间后表示柱效能的物理量，可由下式计算：neff5.54()2=16()2,色谱的定性分析,一般定性 1、用已知物直接对照法定性利用已知物直接对照法定性，是一种简单可靠的定性方法，在具有已知标准物情况下常使用这种定性方法。该方法定性的依据是：在一定的柱条件（柱长、固定相），操作条件下，组分有固定的保留值。因此，控制条件一定，比较已知物和未知物的保留值，就可方便地确定某一色谱峰是什么物质。A、利用保留时间和保留体积定性利用保留时间tR定性是最简单地一种定性方法。只要准确测量未知物和标准物地保留时间进行比较，相同者为同一物质。利用保留时间定性，缺点是tR受操作条件影响大，载气流速微小的波动、稳定微小的变化都会使tR改变，从而给定性带来困难。用保留体积VR定性，不受载气流速的影响，操作也很方便。,B、用相对保留值定性利用保留时间或保留体积定性受条件影响大。保留体积虽不受流速影响，仍受其它操作条件影响。而相对保留值仅受柱温、固定相性质影响，柱长、填充情况、流速等均不影响ris值。因此在柱温、固定相一定时，ris为定值，可作为定性的较为可靠的参数。C、用已知物增加峰高法定性如果样品组成复杂，峰间距小，这时要准确定出保留值有一定困难，峰高增加法是在此条件下最可靠的定性方法。具体方法是：先进一样品，得一谱图，然后在样品中加入一定量的标准物质，同样条件下进一针标样品，从新得到的谱图上看，哪个峰高了，那么，该峰就是加入的标准物组分。,2、色谱定量分析色谱分析的重要作用之一是对样品定量。色谱法定量的依据是：组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。在此，响应信号指峰面积或峰高，表示为：wi=fiAi，其中wi为欲测组分I的量，Ai为组分I的峰面积，fi为比例系数，在此称为校正因子。因此，要准确定量，首先要准确测出峰面积与定量校正因子。定量校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位峰面积所代表的被测组分的量。定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但是，同一含量的不同物质，由于其物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号大小也不同，直接用响应信号定量，必然产生较大误差。因此提出了定量校正因子。定量校正因子对信号加以校正，校正后的峰面积可定量地代表物质的含量。,A、面积的测量 对称峰面积的测量对称色谱峰近似地看作一个等腰三角形，按照三角形求面积的方法，峰面积为AihiW，经验证明该方法计算的面积只有实际面积的0.94倍，故再乘一系数1.065，Ai1.065 hiW，这是目前应用较广的计算法。1、不对称峰面积的测量在色谱分析中，经常会遇到不对称峰，多数不对称峰为拖尾峰，峰面积的计算方法为：取峰高0.15倍处和0.85倍处峰宽平均值，乘峰高：A=(W0.15h+W0.85h)h 峰高在定量分析中的作用峰高也可作为定量指标，对于一定的样品，如果操作条件保持不变，在一定的进样量范围内，半高峰宽是不变的，峰高可直接代表组分的浓度，由峰高代替面积计算。方法快速、简便，适用于固定不变的常规分析。与使用面积定量法比较，对于出峰早的组分，由于半高峰宽很小，相对误差大，这时用峰高定量更准确。对于出峰晚、峰较宽的组分，用峰面积定量更准确。,百分含量的计算,1、归一化法 归一化法是常用的一种简便、准确的定量方法。使用这种方法的条件是样品中所有组分都出峰，将所有出峰组分的含量之和按100计，当测量参数为面积时，计算如下：xi%=100 式中 xi-试样中组分i的百分含量；fi-组分i的校正因子；Ai-组分i的峰面积。如果样品中组分是同分异构体或同系物，已知校正因子近似相等，就可以不用校正因子，将面积直接归一化，即可按下式计算：xi(%)=100 xi(%)=100 归一化定量的优点是方法准确，进样量的多少与结果无关，仪器与操作条件对结果影响小。缺点是某些组分在所用检测器上可能不出峰，样品中含有沸点高，出峰很慢的组分，不需定量的个别组分可能分离不好，重叠在一起，影响面积的测量，使其应用受到一定程度的限制。,2、内标法当分析样品不能全部出峰，不能用归一法定量时，可考虑用内标法定量。方法：准确称取样品，选择适宜的组分作为预测组分的参比物，也称内标物。加入一定量的内标物，根据被测物和内标物的质量及在色谱图上相应的峰面积比按下式求组分的含量;xi(%)=100式中 xi-试样中组分I的百分含量；ms-加入内标物的质量；As-内标物的峰面积；m-试样的质量Ai-组分I的峰面积；fsi=fi/fs。对内标物的要求是：不能与样品或固定相发生反应；能与样品完全互溶；与样品组分很好的分离，又比较接近；加入内标的量要接近被测组分的含量；要准确称量。内标法定量非常准确，主要缺点是：内标物不容易找到；每次需要用分析天平准确称量内标和样品，日常分析使用很不方便，样品中多了一个内标物，显然对分离的要求更高些。,3、外标法外标法又称校正曲线法。用已知纯样品配成不同浓度的标准样进行试验，测量各种浓度下对应的峰高或峰面积，绘制响应信号百分含量标准曲线。分析时，进入同样体积的分析样品，从色谱图上测出面积或峰高，从校正曲线上查出其百分含量。在一些工厂的常规分析中，样品中各组分中的浓度一般变化不大，在检量线通过原点时可不必做校正曲线，而用单点校正法来分析。即配制一个和被测组分含量十分接近的标准样，定量进样，由被测组分与外标组分峰面积或峰高比求被测组分百分含量。xi=Ei式中 xi-试样中组分i的含量；Ei标准样中组分i的含量；AE标准样中组分i的峰面积。该方法的优点是操作简单和计算方便。缺点是仪器和操作条件对分析结果影响很大，不像归一化和内标法定量操作中可以互相抵消。因此，标准曲线使用一段时间后应当校正。,4、叠加法叠加法又叫内加法，是以样品中已有的组分做内标，比较该组分加入前后面积的改变，计算被测组分含量。其步骤如下：先做样品色谱图，然后在原样品中定量加入含量较小组分的纯样品，同样条件下，再进一色谱样得一色谱图。,定量分析误差的来源,除峰面积与校正因子测量精度外，定量结果的准确性还受如下因素的影响：1、样品的稳定性及代表性样品的代表性是得到准确定量结果的前提。气相色谱分析的许多样品是气体或挥发性液体，因此，要特别注意泄漏、挥发等问题，同时，从取样到进样要快速，尽量避免样品组分的挥发损失。液相色谱取样要注意样品的均匀性，样品是否完全溶解组成均匀的溶液，溶解样品的溶剂最好就是流动相，或是与流动相互溶的溶剂。2、进样系统影响采用定体积进样法作定量分析，进样的重复性是一个很关键的问题。对于气体样品，一般都采用进样阀，重复性好，液体样品一般用微量注射器。3、柱系统的影响如果色谱柱不能将组分完全分离，有重叠峰或严重拖尾峰，那么，无论用何种测量方法也会有误差。因此，保证色谱峰良好的分离是定量准确的必要条件。同时要注意保养柱子，以保证良好的重现性。,4、气相色谱操作条件的影响、柱温柱温直接影响保留值和峰高，不同组分保留值的对数值随柱温变化的直线斜率是不同的，如果要减小柱温造成的误差，柱温应控制在0.5范围以内。、检测温度对于热导池检测器，温度升高，灵敏度下降，它的影响比柱温影响小，允许温度变化1。、载气流速的影响对于热导池检测器，是测量流动相中组分浓度的瞬间变化，即响应信号与流动相中组分浓度成正比。流速加大，浓度不变，故峰高与流速无关，峰面积与流速成反比。对于氢火焰离子化检测器，测量的是单位时间进入检测器的物质量。流速加大，单位时间进入的量增大，峰高增加，面积与流速无关，因此在绝对定量时，用面积定量误差小一些。,高效液相色谱法,液相色谱是色谱中的一类分离与分析技术，其特点是以液体作为流动相。对于大量有机化合物、离子型化合物以及易受热分解或失去活性的物质，不能直接或不适合用气相色谱方法进行分析，因此高效液相色谱的应用领域不断扩大和深入。特别是近几十年来，液相色谱固定相的高度发展，仪器不断更新，高效液相色谱目前已成为许多学科科学研究和日常分析的重要手段。,一、高效液相色谱法的特点,1、高效液相色谱可以分离分析高极性，高分子量和离子型的各种物质，只要被分析对象能够溶解于可作为流动相的溶剂中并能够被检测，就可以直接进行分析。某些目前尚不能被直接检测，或检测灵敏度不够的，也可以采用各种衍生技术，实现这些物质的检测。2、高效液相色谱仪主要由高压输液泵、进样阀、柱子和检测器等组成。3、柱子的柱效（以理论板数计）很高，每米可达3万块以上。一般只使用2025cm长的柱子。由于填料的不断发展和改进，目前最短的柱子只有3cm长，板数可达30004000。已能够满足一般分析的需要，并具有很高的分析速度。,4、高效液相色谱仪通常在室温下操作，样品一般不须预处理，操作简便，很容易掌握。5、高效液相色谱操作的难点在于流动相的选择。可以采用纯溶剂，二元或多元混合溶剂作流动相。但流动相的选择必须遵循一定的规律，并以科学的方法优选。6、高效液相色谱技术也存在一些问题。柱子价格昂贵，要消耗大量的溶剂，而且许多溶剂对人体是有害的。高效液相色谱仪的价格和损耗也比气相色谱仪高。此外，尚缺少象气相色谱中氢火焰离子化检测器那样的通用型、高灵敏度的检测手段。因此，高效液相色谱无论在技术上，在理论上，还是在应用上都处于发展阶段。,二、高效液相色谱系统,下图是高效液相色谱系统的示意图。它由输液泵为核心的输液系统、进样器、柱子和检测器四个基本部分组成。实际仪器比图要复杂得多，它们可能有几个泵，几种检测器，自动进样系统，柱合检测器的温度控制系统等。,1、输液系统输液系统的作用是向柱子提供压力高，流速稳定的流动相。它以高压输液泵为核心，由溶剂储槽、过滤器、输液泵、梯度溶剂混合器等组成。为了测量系统流量和压力，在输液系统的输出通路上还安装了不同类型的传感元件。储液槽储液槽是盛装溶剂的容器。它可以是一个普通的溶剂瓶，或是一个专门设计的储液槽，用于除去溶剂中的气体。过滤器各种泵的柱塞、进样阀的阀芯加工的精密度都非常高，微小的机械杂质将导致这些部件的损坏，而不能很好的工作。同时杂质在柱头的积累还影响柱子的使用，增大柱压，因此过虑溶剂，设置过滤器是必须的。过滤器的芯子通常是一个由多孔聚四氟乙烯制成的具有一定空隙度的圆柱体，镶嵌在一个不锈钢的壳体中，形成一个完整的、安装方便的部件。,高压输液泵高压输液泵是现代液相色谱装置中最关键的设备，输出高压溶剂是实现快速分析的前提。除了最高使用压力外，还有线性流量范围，输出流量的精确度，泵的操作方式，流量输出或压力恒定的稳定性，以及易于操作和维修等。高效液相色谱仪中所用的泵可分为两类：恒压泵和恒流泵。恒压泵主要指气动放大泵，泵出口压力在系统中是恒定的，流速由柱的阻力决定。恒流泵有往复泵和注射泵，这类泵输出的溶剂流量恒定，柱前的压力由柱后的阻力确定。目前使用最多的是往复泵。,梯度洗脱装置当样品是一个含有不同种类组分的复杂混合物时，通常用一种纯的或固定组成的混合溶剂难以实现满意的分离，往往是先溜出来的峰分不开，而后溜出来的峰保留时间太长。因此，在液相色谱中常在一个样品的分析过程中，不断调整混合溶剂的组成，改变溶剂强度或溶剂的选择性。如果溶剂组成随洗馏时间按一定规律变化，称这种洗馏过程为梯度洗脱。梯度洗脱过程溶剂组成的变化可以是线性的，也可以是非线性的；可以是二元的，也可以是三元，甚至多元溶剂的混合。梯度洗脱装置根据溶剂混合时的压力分为两种类型：低压梯度和高压梯度。,低压梯度是溶剂在常压下混合，然后用一个高压输液泵把它输送至柱系统中。多元溶剂在混合室或溶剂罐中混合，并以一定速度改变溶剂的组成。这种方式简单、经济，只能用往复泵。高压梯度使用两台高压输液泵，每台输送一种溶剂，两台泵输出的溶剂在一个混合室内混合。每台泵的溶剂流量由独立的电路或计算机控制，它们按一定比例改变。对于梯度系统系统来说，关键是要保证流速的稳定，梯度洗脱洗脱重现性好。因此混合室的体积应尽可能地小，且不存在死角。,进样装置在液相色谱中，进样方式有微量注射器进样，进样阀进样，自动进样装置等。高效液相色谱最主要的特点要求进样器设计要耐高压，死体积小，与溶剂接触的部分具有很好的耐蚀性。进样口处的隔垫把系统和外界分开。为了使隔垫能承受上百公斤的压力，顶盖的通孔很细，而且长。在系统处于高压时，用一根金属棒压住隔垫的通孔部分，避免内部压力太大把隔垫冲破。液相色谱的进样口目前大部分都是采用六通阀，六通阀进样的原理如图所示。,进样时样品中不应混入杂质。溶解样品的溶剂最好和使用的流动相一致，以防止溶剂变化出现不溶物而堵塞柱子。,检测器检测器在色谱系统中非常重要。因为液相色谱系统的所有特性都通过检测器的输出信号表现出来。目前液相色谱仪常备的检测器主要是紫外分光光度计和光二极管阵列检测器，示差折光仪，荧光检测器。紫外和示差折光检测器是液相色谱最基本的检测器，下面介绍这两种检测器的工作原理。,紫外、可见紫外分光检测器这种检测器在液相色谱中应用最广。几乎是一切色谱仪必备的检测器，它的特点是：噪音低、具有相对高的灵敏度、结构简单、易于维修。紫外检测器的工作原理是：当一束紫外光通过样品池时，入射光的一部分被溶液中的某种物质吸收，吸收的多少取决于溶质的性质。溶质的浓度和响应值之间存在线性关系。紫外检测器有固定波长检测器，可变波长检测器两种可变波长检测器采用氘灯或氘灯与钨丝组合的光源，波长在190800nm范围可调。,示差折光检测器示差检测器的工作原理每一种物质在一定的温度、压力等条件下都有固定的折光指数。样品组分从柱中洗馏出来与流动相组成一混合物，它的折光指数与纯流动相或纯溶质都不相同。示差折光检测器就是以纯溶剂作参照物，连续监测柱后洗馏物折光指数的变化，并根据变化的差值决定样品中各组分的量由于折光指数具有加合性，任何溶剂都具有一定的折光指数，因此对所有物质都有响应，是通用型检测器。,三、高效液相色谱柱,1、柱型目前液相色谱常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm,长度为2025cm的不锈钢柱。柱流动相的体积流速是每分钟1ml左右。填料颗粒度510m，柱效以理论板数计大约在700010000。液相色谱柱发展的趋势，一是减少颗粒度（35m）提高柱效，缩短柱长，提高分析速度。另一方面是减小柱径，节省溶剂用量，提高检测浓度，特别是用于复杂组分的分析。,2、柱的选择性柱的选择性主要指柱固定相对分离的控制。固定相对不同类型的化合物有一定的选择性。选择固定相的一般标准还是以“相似相溶”原理为基础。如果溶质溶于烃类溶剂，表明它是低极性化合物，这样就可以选用非极性或亚极性固定相。若样品溶于极性溶剂中，如醇类，则可选择极性固定相，也可以选择非极性固定相。实际上，在液相色谱中，由于每一种分离方法所用固定相的种类很少，分离主要靠溶剂的选择。由于十八烷基（ODS或C18）柱能够用于多种化合物的分离，因此它是最常用的固定相。,3、柱效的评价 要实现对溶质分离，要求柱子具有很高的柱效。影响柱效的因素很多，对柱效的评价也就比较难，一般是测定它们的理论板数n，板数n主要依赖于保留时间（tR）与峰底宽度（Wb）的比值。Wb越窄，这项比值越大，柱效越高。同时还要考虑柱的渗透性，即操作条件下的最小进口压力，以及峰的对称性。商品柱子在出厂时都附有一张标准谱图，根据所标明的条件，得到重复的谱图，说明这根柱子是合格的。柱子经过长期使用或保存不当，柱子的性能会下降。突出的表现是在给定溶质和溶剂等操作条件下，峰变宽且对称性不好，可K值下降。,计算峰不对称性的方法见图，峰不对称性因子是在峰高10处测量的。如果柱子引起峰的不对称性大于1.2，说明改柱子的质量不好了，若超过1.6，则这根柱子就不能再使用了。,四、液相色谱流动相及其选择性,1、流动相的作用 在给定固定相的情况下，溶质的保留和对溶质的分离主要由溶剂的性质决定。在液相色谱中，溶剂可以是非极性的，也可以是极性的。如果与固定相的极性相比，溶剂极性小于固定相的，称这种色谱过程为正相液相色谱。如硅胶作为固定相，正己烷作为流动相的吸附色谱过程。如果与此相反，溶剂的极性大于固定相，如以ODS键合相作为固定相，水和甲醇等作为流动相的分配色谱过程，称为反相液相色谱。有的固定相，如NH2基键合相，可以使用非极性溶剂，极性溶剂，PH27的磷酸缓冲液作为流动相。因此，正相与反相的概念是相对的，取决于两相极性的比较。在液相色谱中溶剂还用来溶解样品，并用于样品的预处理中。总之，溶剂在液相色谱中是非常重要的，不应和气相色谱中的载气比较，因为后者只起携带样品的作用。,2、作为流动相的溶剂性质,溶剂的种类和数目是很多的，但是可作为流动相的溶剂的数目相对来说是很少的，说明溶剂的选择在液相色谱中是比较不容易的。1所有的溶剂；2具有合适物理性质的溶剂；3K值合适的溶剂；4值合适的溶剂,可作为流动相的溶剂至少应该具备如下一些性质：、溶剂具有稳定的化学性质。它不能和固定相发生不可逆的化学反应，也不引起固定相表面活性基团的流失及基质的溶涨。除特殊的分配过程，溶剂只溶解样品，而不发生化学反应。、溶剂的选择与使用的检测器要有相溶性。在使用紫外检测器时，溶剂应该在选定的紫外区没有吸收，或在溶质最大吸收波长段没有吸收。使用示差折光检测器时，溶质和溶剂的折光指数应有较大的差别，否则检测灵敏度不够高。、溶剂粘度既影响系统的压降，也影响分析时间。因此使用粘度小的溶剂作为流动相在降低操作成本和加速分析时间方面具有明显的意义。,溶剂可以从市场买到并易于纯化。在某些分析中，特别是检测灵敏度高时，溶剂的纯度要求很高，所以溶剂应易于获取并易于纯化。溶剂的沸点不应太低。如果沸点太低在溶剂传输过程中易出现气泡，它将影响输送流量的精度和混合溶剂的组成。溶剂的毒性应尽可能小，并不易起火。大多数溶剂对人体都是有害的，因此操作者应该注意溶剂使用中的各种安全措施。成本低。使用液相色谱分离或分析样品要消耗大量的溶剂，这些溶剂使用后一般都不再回收，因此应尽可能使用低成本溶剂。,3、常用的溶剂 在日常工作中比较常用的溶剂是有限的十几种，如表中列出的16种常用溶剂的性质，其它可选择的溶剂还有：异丙醇、丁醇、异丁醇、环己烷、乙醚等。,在液相色谱中不仅使用纯溶剂，更经常使用二元或多元溶剂的混合流动相，以调节流动相的洗脱强度或流动相的选择性。,4、缓冲溶液和流动相添加物,在色谱分离过程中常使用缓冲溶液作为流动相，有时只在流动相中添加少量的酸，以保持流动相的氢离子浓度（PH值），提供一定的离子强度。它通过控制酸性或碱性化合物的离解度或络合物的络合常数，达到调整保留时间和分离的目的，也有助于某些化合物峰形的改善。常用的酸是磷酸、醋酸及其它弱酸。缓冲液是这些酸和它们的盐所构成的水溶液。一般是先确定盐的浓度，通过加入酸的办法调整合适的PH值。磷酸的PH值范围为3.7 5.6，5.88.0，醋酸的PH值范围在1.83.5之间。选择介质和PH值除了考虑被分析样品外，还要考虑色谱系统所用的材料及固定相承受的能力。因为普通色谱系统使用的材料，包括柱管、泵和检测器等，主要是不锈钢，因此对不锈钢有侵蚀作用的酸不宜选用。以硅胶为基体的固定相，PH值在27之间，高于或低于这个范围，由于固定相的不稳定会失去分离效能。,流动相添加物主要指为了某些化合物的分离在流动相中添加一些物质，这些物质与被分析化合物通过共价键、氢键、偶极矩的相互作用形成各种形式的络合物、鳌合物等改变其原有的化学性质，达到分离的目的。在流动相添加手性试剂，利用非手性固定相可获得旋光异构体的分离等。在流动相中添加少量精心选择的试剂，不仅改善了某些化合物的分离，也扩大了色谱的应用范围。,5、液相色谱的分离度 液相色谱过程的最终目的是实现多组分混合物的分离。色谱中用分离度（R）衡量相邻物质峰的分离程度，它的定义是 R=tR/WbtR是相邻一对物质的保留时间差（tR2tR1），Wb是它们峰低宽度的平均值（Wb1Wb2）/2。R=1表明两种溶质基本被分开。R=1.5时实现完全分开。要改善分离度，最好的办法是选择合适的溶剂。,6、梯度洗脱 在液相色谱分离过程中不断改变溶剂组成的方法称为梯度洗脱。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，保持好的峰形，增加溶剂的选择性，保证多组分的分离，提高样品中各物质的分离程度。,五、柱子的维护,高效液相色谱柱子的价格很高，要维持柱子较长的使用寿命应注意以下几点：1、固定相对流动相的要求，如溶剂的化学性质、溶液的PH值等2、在使用缓冲溶液时，盐的浓度不应过高，且日工作结束后要及时用 纯溶剂清洗柱子，不应过夜。3、样品量不应过载，脏样品应预处理，最好使用预柱保护分析柱。4、当柱前压力增加或基线不稳时，往往是柱子被玷污所致，可通过改变溶剂的办法使不溶物溶解，柱子再生。正相柱使用水，甲醇等极性溶剂，反相柱使用氯仿或氯仿与异丙醇的混合溶剂。5、柱子应该永远保存在溶剂中，键合相最好的溶剂是乙腈。水和醇或它们的混合物都不是最好的选择。,六、溶剂脱气,在常温、常压下水和有机溶剂都溶解一定量的气体，如果不除去可能带来许多问题。如：产生气泡、空气中的氧可能导致检测器的噪音，灵敏度下降或者它们会氧化分析物，损坏柱子。因此溶剂在使用前需要脱气。,七、高效液相色谱操作规程,方法编辑、保存,