《肿瘤基因治疗》PPT课件.ppt

,肿 瘤 的基 因 治 疗,一.基因与肿瘤 与遗传疾病不同,与肿瘤相关的基因突变大多是获得的、多发的，并且在很大程度上尚未被清楚地认识，与肿瘤发生直接相关的基因包括癌基因及肿瘤抑癌基因。（一）、癌基因 近年来的研究表明，癌基因是正常细胞生长和发育的必要成分。在进化过程中，这些癌基因从真菌到人类保持高度的保守性。在生理条件下，这些基因被称为原癌基因。原癌基因蛋白产物在细胞的生长与发育的信号传递过程中发挥重要作用。这种作用一旦失控，常常使细胞走向恶性转化。在100余种已被确定的原癌基因中，只有一小部分被证明与人类肿瘤的形成密切相关。,一些常见的癌基因及其相关的人类肿瘤 功能 癌基因 相关的人类肿瘤生长因子 HST 胃癌生长因子受体 NEU/ERB-B2 乳腺癌、卵巢癌、胃癌 ERB-B 乳腺癌、神经系肿瘤信号传导蛋白 Ha-RAS 膀胱癌 Ki-RAS 肺癌、结肠癌 N-RAS 白血病蛋白 RAF 胃癌 ABL 白血病/淋巴瘤转录因之 Myc 淋巴瘤、多种癌症 L-Myc 小细胞肺癌膜蛋白 MAS 乳腺癌 BCL-2 滤泡型、未分化的淋巴瘤,这些原癌基因一经异常激活，常常导致细胞的恶变，其作用机制如下：1过量的生长因子可导致细胞的增殖失控。2过多的或异常的生长因子受体可以持续地处于激活状态，甚至不需要与 相关的生长因子结合。3.异常的蛋白激酶会扰乱细胞的正常调控。4过多的或异常的转录因子可导致基因的异常转录，从而刺激细胞的异常生长与复制。,癌基因与人类肿瘤 目前已鉴定出许多与肿瘤细胞相关的癌基因，进一步研究癌基因在肿瘤中的作用。（1）Ras基因变异与肿瘤 研究表明，约10%15%的肿瘤至少有三种Ras，因中一种的点突变，其中K-Ras基因更易称为突变的基因。K-Ras基因点突变集中在第12位氨基酸残基，少数病理中也有第13位及第61位点突变。约50%结肠癌、70%90%胰腺癌、30%的肺癌均有Ras点突变。在正常细胞中，每一种Ras基因都分别编码一种鸟苷酸结合蛋白。Ras蛋白在细胞增殖分化信号从激活的跨膜受体传递到下游蛋白激酶的过程中起作用。其结果导致Ras蛋白与GTP（三磷酸鸟苷）的持续结合具有促进细胞增殖作用。研究表明，采用针对Ras基因的变异将Ras基因的功能失活，可抑制肿瘤的恶性生长，进一步证明纠正突变型Ras引起的信号传导通路的异常可能是一条控制肿瘤细胞恶性化增殖的有效途径。,（2）Myc基因变异与肿瘤 Myc基因是一种癌基因。通过染色体易位而活化，通常通过第8号染色体与第14号染色体间易位，破坏Myc基因的调控，在某些肿瘤细胞中Myc基因还受DNA扩增的影响。Myc基因在细胞生长调控中具有重要作用，一旦发生突变，导致细胞恶性增殖。此外：Nen基因变异与卵巢癌、乳腺癌及胃癌等，c-Met基因变异与胃粘膜病变，Bcl-2基因与细胞凋亡等都是研究热点。（3）端粒酶 端粒是真核细胞线形染色体末端由段粒DNA和端粒蛋白质构成的一种特殊结构。人的端粒DNA序列由5向3方向的（TTAGGG）n重复串联组成。正常情况下，随着细胞分裂，端粒的进行性缩短并诱发一系列分子事件，最终导致细胞凋亡。端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，以自身RNA为模板合成端粒DNA并整合到染色体末端，使染色体延长，从而延长细胞的寿命甚至是细胞永生化。绝大多数正常体细胞端粒酶为阴性，普遍认为端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生与发展密切相关。端粒酶的活化涉及一系列基因的表达和调控的变化，从而导致细胞增殖分化的异常。,癌基因与肿瘤的预防诊断和治疗（1）环境致病因素抑癌基因变异的积累 目前认为，任何一种肿瘤都与一种致病微生物相关，并往往伴某一类型的慢性炎症。去除致病因素，阻断细胞癌变是预防肿瘤发生的关键。如早期发现RNA病毒通过影响宿主细胞的基因而与肿瘤发生相关，煤焦油中的化学物质作用于DNA引起细胞癌变及诱发肿瘤。这些被确定为细胞癌变的重要因素。同时多种肿瘤具有家族聚集现象，因此遗传易感性是另一个致癌因素。在这些因素作用下，癌基因发生突变等导致肿瘤发生。说明肿瘤的发生发展是全身代谢障碍性导致的疾病。肿瘤的发生与发展是多基因以多种形式变异积累的病变过程，任何一个单基因都不能从基因水平阐明肿瘤发病的分子机制。,（2）细胞癌变的分子模型与肿瘤相关基因的鉴定 以胃癌研究为例：胃粘膜慢性病变不同阶段中某些肿瘤相关基因变异方式、频率给与病变演化关系。根据对处在不同阶段的胃粘膜组织的分析（正常胃粘膜、浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生、胃癌），初步确定在胃癌中检出高频率的基因变异，包括癌基因的扩增、重排、点突变、过量表达。抑癌基因缺失、点突变、过量表达和基因甲基化改变，此外，在胃粘膜病变异型性增生和肠上皮化生中也检测到p53和Ras基因的点突变及基因Met、ErbB2、Akt2过量表达。研究表明，基因过量表达多发生在细胞癌变的起始阶段，基因点突变可能是细胞癌变启动阶段的一个主要事件，这一阶段的可逆性较大；基因扩增、重排多发生在癌变的促进阶段，癌变细胞可能开始向不同的生物学行为分化，可能表现出多样性和异质性；基因缺失不仅能导致癌变细胞生物学行为的多样化并导致癌变细胞增值分化平衡失调，促使肿瘤迅速发展。,癌基因与肿瘤生物学的关键科学问题 随着基因组、蛋白组学研究的进展和生物芯片技术的发展，以下几个科学为题有助于进一步阐明癌基因与肿瘤的关系：（1）基因与不同肿瘤细胞的信号传导；（2）癌基因变异与肿瘤的易感性；(3）癌基因与不同个体肿瘤的生物学特性；（4）癌基因与机体内外环境平衡调控的分子机制；（5）癌基因表达时空性与细胞的更新换代；（6）癌基因与肿瘤的临床病理学基因分型。,抑 癌 基 因 在肿瘤发生中，有一种通过纯合缺失或失活而引以恶化的基因，被称之为抑癌基因，这类基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用，并能潜在的抑制肿瘤生长，如果其功能失活或出现基因缺失、突变等异常，可导致 细胞恶性转化而发生肿瘤。抑癌基因的生物学功能与癌基因相反，他们是机体细胞在增殖、分化、凋亡等生命过程中正和负两类调控信号，癌基因的调控属正信号，而抑癌基因的调控属负信号范围。确定一种抑癌基因需要在理论上符合三个条件：（1）该恶性肿瘤的相应正常组织中该基因必须正常表达；（2）该恶性肿瘤中这种基因应有功能失活、结构改变、表达缺陷；（3）将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞内，可部分或全部改变其恶性表型。目前研究，还未发现任何一种抑癌基因的异常存在与人类全部肿瘤中，均表现为不同频率的异常。,抑癌基因大多属于一类对细胞增殖产生负调控作用的基因及其产物，其促癌作用一般是在两个等位基因都丢失或失活后才显示出来，故发现和分离都比较困难。目前已被克隆的抑癌基因和未被可隆的候选抑癌基因已达30余种，而且新的抑癌基因还在不断出现。例如：基因名称 染色体定位 基因产物定位 常见主要肿瘤 P53 17P13 细胞核 多种肿瘤 P16 9q21 细胞核 多种肿瘤 P19 19p13。2 细胞核 多种肿瘤 Rb 13q14 细胞核 视网膜母细胞瘤 APC 5q21 细胞膜 结肠癌 FHIT 3p14。2 细胞质 消化道肿瘤、肾癌、肺癌等 等。,以p53 基因为例：p53基因是基因研究最为深入的肿瘤基因之一。人类肿瘤中约50%以上与p53基因变化有关，仅19912002年1月的相关文献超过9800余篇，p53基因也被Science杂志评为1993年的明星分之子。P53基因的结构和生物学特性P53基因全长约20kb，定位在人类染色体17p13.1，由11个外显子组成，编码393个氨基酸组成的53kb的核内磷酸化蛋白，具有蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合的功能。现已明确p53是细胞生长周期中负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。P53可正调节一些在细胞增殖周期调控过程中起关键作用的基因，包括可调CDK活性的p21和DNA损伤导致的细胞生长受阻相关的GADD45基因。P53突变可影响与DNA相互作用的关键氨基酸，也可由于p53基因突变蛋白发生错误重叠而不能与特定的DNA识别序列相互结合。P53在细胞内的核心作用是介导DNA顺伤后的细胞应激反应，维持遗传稳定性。对细胞周期的调节主要是在G1/S控制点起作用，以决定细胞是否启动DNA合成，而在另一些情况下，却决定细胞是否进行程序化死亡。P53的失活可使肿瘤细胞进一步出现基因组的不稳定性，突变型p53则具有癌基因的作用，促进细胞恶性化。,P53基因异常与肿瘤 P53基因的缺失或突变已被证实是许多肿瘤发生的原因之一。自1989年以来，人们发现在多种不同类型的肿瘤中发现了p53基因的突变，其频率可达50%60%，其突变的形式可表现为点突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重排等。目前已知的突变位点约有3500余种，大多数集中于第58外显子。P53基因异常的另一个形势为等位基因的缺失，特别是当一个等位基因发生突变时，另一个等位基因便存在缺失的倾向，这种两个等位基因都缺失的现象在结肠癌、乳腺癌发生频率较高。另外，p53基因甲基化状态的变化也是较为常见的基因异常。,P53基因产物的研究进展P53蛋白具有与双链或单链DNA结合的能力，同时还具有与DNA病毒编码产物结合的能力。P53基因突变和等位基因缺失是导致p53蛋白表达异常的主要原因，由于突变型p53蛋白的半衰期可延长至612小时，所以用抗p53蛋白的抗体通过免疫组化法检测肿瘤组织，过表达常提示p53基因存在错义突变，应用这一方法可为一些肿瘤如乳腺癌提供临床预后的指标。然而新近的研究表明,，除突变性p53蛋白可以增加在细胞内积聚外，如果以某种结合的方式存在，特别是与肿瘤性DNA病毒编码产物结合，也可使细胞内p53蛋白集聚，含量增加，导致其正常的负调节功能丧失。,P53基因对细胞内基因转录的调节P53除可以与某些病毒癌蛋白结合外，还可以与细胞内的转录因子结合，起到活化和调节作用，目前已发现p53激活转录的基因有107种，抑制转录活性的基因有54种，其中关系较为密切且进行较深入研究的相关基因有十几种。激活转录：Bax、Fas/Apol、CyclinG、GADD45、GD-AIF、HIC1、MCK等。抑制转录活型：P21WAF1/CIP1、BcL2、C-myc、FGF、C-fos、HSP70等。P53蛋白在调节细胞周期和基因稳定性方面的研究也有很大进展。在细胞周期中，当DNA受到损伤后，便停止DNA的修复，使细胞停留在G1期，如损伤的DNA被修复，则可进入S期，如果损伤严重而不能修复，则会出现程序性死亡。野生型p53基因对控制细胞周期、维持细胞遗传稳定性具有重要作用，认为可能是通过GADD45及Mdm2行使调节作用。,因为P53的突变与缺失几乎发生于人类绝大多数肿瘤中。科学杂志将P53列为1993年“年度分子”。对其它一些肿瘤抑癌基因的研究仍在进一步发展中。（三）、肿瘤的发生 单基因引发的肿瘤(视网膜母细胞瘤)只占人类肿瘤的少数。而常见的上皮细胞肿瘤包括乳腺癌、肺癌及结肠癌则可能起因于多种基因突变的长期积累效应，而肿瘤的发病率随年龄增加而增加，环境因素和遗传因素在肿瘤的发病中都有一定作用。一系列突变的积累影响了细胞正常的监控调节机制，从而导致肿瘤的发生。这些突变的不断积累造成从癌前病变至癌症，以至癌性克隆化异原性增生的晚期肿瘤。正常结肠上皮细胞逐步转化为恶性转移性结肠癌的过程可能是突变积累系统性研究的范例之一。在这一研究中发现将结肠癌变的组织学发展过程与癌基因及肿瘤抑癌基因的突变有机地结合起来。认为这一癌变过程起因于第五对染色体长臂的基因突变（遗传或散发性的的）。从而导致上皮细胞的高增殖状态。DNA的进一步去甲基化可能导致某个肿瘤细胞抑癌基因的复活，细胞可能发展至早期腺瘤。早期腺瘤中的某个细胞随后可能获得RAS基因的突变，从而克隆化增殖为更大的退变的腺瘤。进一步丢失第18对染色体长臂和第17对染色短臂（从而使抑癌基因P53丢失），导致癌症的进一步发生及进展。目前理论认为，这一突变积累过程可能与大多数肿瘤发生有关。,基因转移与抗肿瘤化疗抗肿瘤化疗是有效地控制肿瘤生长的治疗方法之一，近年来进展相当迅速。但是，抗肿瘤化疗一个难以避免的缺点，是抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤了某些正常细胞，其中特别是正常的造血祖细胞，导致患者机体免疫力更为低下。因而，增加正常造血祖细胞对化疗药物的抗性，或选择性使用特异性杀伤肿瘤细胞的药物，将大大提高抗肿瘤化疗的效果。（一）、.基因转移促进成血器官对化疗的抗性增加正常血原细胞对化疗药物的抗性，有利于提高化疗药物的剂量，从而可增加化疗的效应。但是，由于肿瘤抗药性机理相对复杂，并且种类多，很多机理在研究中。目前研究较多的是多药抗性原理（MDR）MDR的基因产物是一个跨膜的蛋白分子，作为分子泵，它可以将某些化疗药物泵出细胞外，从而导致肿瘤的抗药性。MDR可以抗许多种化疗药物，利用MDR增加成血原细胞对化疗药物的抗性已在小鼠实验成功。化疗后，含MDR基因的周围血细胞从疗前的1%增加至7%。临床初步实验已开始。目前关键的问题是这一方法的临床效果如克？是不是比自身骨髓移植合并成血因子添加的技术更为有效？待进一步研究。,（二）、原药激活疗法（GPAT）选择性杀伤肿瘤细胞的药物的筛选与应用，是抗肿瘤化疗研究的重要课题。利用肿瘤细胞区别与正常细胞的代谢特点，并结合化疗药物在体内代谢的特点。人们可以设计出特异性杀伤肿瘤细胞的化疗方案。近年来发展起来的原药激活疗法（GPAT）就是利用上述原理并结合基因转移技术的一种化疗方法。原药激活疗法（GPAT）的理论基础如下：1 肿瘤细胞特异性抗原，肿瘤相关抗原，以及癌基因常常作为鉴定肿瘤细胞的标志，其自身特异性的表达是涉及肿瘤靶向治疗的重要依据；2 化疗药物在体内代谢可以产生不同的中间产物，因而根据药物的代谢特点，可以设计肿瘤靶向治疗的方案；,3 化疗药在体内的代谢常常需要一些酶的残余，主要是核酸代谢途径的一些酶类，随着基因转移技术的不断的成熟和应用，人们将特异性药物代谢酶基因导入肿瘤细胞中，这种原药激活酶的表达与分泌决定着化疗药（常常是原药）的代谢途径；4 利用正常与肿瘤细胞转录控制的差异，可以选择性使用这些酶基因的表达与分泌局限于肿瘤组织，从而减少对正常细胞的不利影响。目前已发现许多基因可以作为原药激活酶基因，其中三个酶被认定是GPAT方法的模型(1)、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（HSV-tK）其终产物作用是抑制DNA多聚酶。(2)、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（VZV-TK）(3)、胞嘧啶脱氨酶 其终产物作用是抑制DNA和RNA的合成,肿瘤抑癌基因P53治疗肿瘤作用的检测方法（一）、P53基因在肿瘤抑癌基因重，P53基因是被最广泛研究的。P53基因未於17P染色体，它的突变或等位丢失在人体恶性肿瘤中最常见。大多数组织和细胞有P53基因表达，正常人P53可以控制细胞循环周期，调节转录，DNA复制和诱导细胞程序化死亡。今年研究发现，由逆转录病毒携带的P53基因转移到人肺癌细胞后，P53表达，抑制癌细胞生长。这种用于治疗目的的基因，必须高效率的传送并转移到瘤细胞，且能在肿瘤中产生高效率的表达。经过多种载体的比较，发现腺病毒具有许多优点，容易操作，可获得高滴度的产品109-1012Pfu/ml，感染多种细胞并具有高感染率。近来应用重组腺病毒做载体，在气管滴注，肌肉注射，周围静脉注射和脑内种植等动物实验中，获得很大成功。,（二）、P53基因抑制肺癌细胞生长的实验方法1、基因转移效果和表达的检测（1）、感染性测定（2）、细胞内腺病毒载体和P53基因的检测-PCR测定法（3）、P53基因表达分析-Western蛋白质印迹法2、基因抑制肿瘤生长的检测（1）、细胞生长测定（2）、旁作用分析如感染P53基因的细胞，可表达P53，并可抑制周围细胞的生长，则无感染组与感染、P53基因组混合培养的细胞计数会明显低于其他组。流式细胞仪做细胞程序死亡染色计数，观察实验组与对照组细胞死亡程序死亡数目的增减。,小 结:1.简述癌基因的作用机制?2.简述p53基因的作用机理?,