《聚丙烯凝胶电泳》PPT课件.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白,电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。,电泳基本原理：,COO-COO-COOH+H+H+Pr Pr Pr+OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PHPI,蛋白质N端游离氨基，C端游离羧基以及侧链上一些基团在一定pH条件带电荷，因此可以用电泳技术分离和鉴定。,电场力 F=XQ（X：电场强度，Q：电荷量）,阻力 F=6（：半径，：介质粘度）,当电泳颗粒匀速运动:,F=F,QX=6,/X=Q/6,带电粒子的迁移率,/X 用U表示，称迁移率（mobility）,即单位电场强度时粒子运动的速度，取决于带电粒子的电荷量Q、粒子大小和形状。Q越多，V越大；r越小，V越大；球形分子纤维状,影响电泳速度的因素：,样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：电压电泳介质的pH和离子强度电渗作用,按凝胶装置分为盘状电泳及板状电泳盘状电泳通常是不连续系统，利用缓冲液离子成分、pH、凝胶孔径进行电泳，带电颗粒电泳时具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。,聚丙烯酰胺凝胶电泳分类,以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是单体聚丙烯酰胺（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的，催化剂为过硫酸铵(AP)，加速剂为四甲基乙二胺TEMED,形成三维网状凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,PAG）的聚合反应：,缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25m的厚度。,三大效应：浓缩效应,有效迁移率=迁移率 解离度,分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。,实验步骤,1.制备PAGE胶柱 画线，封口：在一端取7cm和7.5cm两处画线，此 端管口插入橡皮垫。制备分离胶：配制好7.5%分离胶，缓慢注入玻璃管 7cm处，加水防止氧化，室温下聚合 聚合20-30min。制备浓缩胶：配制好3%浓缩胶。将胶上层水倾倒出 去，用滤纸吸干余水。加浓缩胶，封 水。室温下聚合20-30min。,2.上样和电泳：将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡,加样品液50l至浓缩胶面。加电解液直至装满上电泳槽。电泳约1.5hr。3.染色，观察结果：将胶从玻璃管中取出，注意不要弄断凝胶。凝胶考马斯亮蓝染色，然后脱色，脱色至背景清晰。观察结果。,结果示意图：,2 1,清蛋白,1丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。2制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。3注意观察实验现象：分界面，浓缩效应.4.氨基黑染色脱色染液回收。5固体胶切忌倒入水池。,注意事项：,