《组织工程讲座》PPT课件.ppt

心血管疾病组织工程学,中南大学湘雅二医院胸心外科湖南省心血管疾病研究所吴忠仕,讲义提纲,组织工程学基本概况 组织工程血管研究 组织工程瓣膜研究 心肌细胞移植研究 生物反应器,组织工程学研究涉及到材料学、工程学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、临床医学、伦理学等多学科交叉与结合,组织工程,组织工程概况,器官移植,制造组织器官,生物工程,基因工程,组织工程,Tissue engineering is the application of the principles and methodsof engineering and the life science toward the fundamentalunderstanding of structure-function relationships in normal andpathological mammalian tissue and the development of biologicalsubstitutes to restore,maintain or improve functions.Skalak and Fox(eds.),Tissue Engineering,Alan Liss,1988,Tissue engineering is an interdisciplinary field that applies the principles of engineering and the life sciences toward thedevelopment of biological substitutes that restore,maintain or improve tissue function.Langer and Vacanti,Science 260,1993,组织工程定义,The Age of Tissue Engineering is upon us.As we are thrust toward a new millennium so too are our beliefs that the amalgamation of engineering and medicine will result in an explosion of knowledge that will enhance our understanding of developmental biology and culminate in a new era in medicine enabling us to restore lost tissue function.Mikos and Vacanti,Tissue Engineering 1,1995,The goal of tissue engineering is to restore function through the delivery of living elements which become integrated into the patient.Vacanti and Langer,Lancet 354,1999,Tissue Engineering is also often referred to as regenerative medicineand/or reparative medicine.,组织工程的定义,组织工程的基本要素,组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织,国外组织工程学研究,Tepha公司和波士顿儿童医院获得美国商务部200万美元Advanced Technology Program研究基金，用于人工心血管组织的研制,美国研制出人工心脏,英国：利用骨髓干细胞 修复受损心肌,在美国，目前已经形成价值 60亿美元的组织工程产业，并以每年25%的速度递增 培育的骨骼、软骨、血管、皮肤以及神经组织正在进 行体内实验 再造的肝脏、胰脏、乳房、心脏、手指、角膜等正在 实验室里生长成形 据估计全球组织工程及其技术衍生产品则约有1000亿美元的潜在市场可供开拓,国外组织工程学研究,国内组织工程研究,1994年中国组织工程在上海起步（曹谊林）1998年，国家“973”重点计划将“组织工程的基本科学问题”研究课题立项 中国修复重建外科杂志1997年开辟专栏介绍组织工程 中国组织工程和再生医学网 中国组织工程 1999年在中国修复重建外科学会下建立了组织工程学组 2004年曹谊林教授采用人体自身骨髓基质干细胞培养出了组织工程化的人 体骨骼，最近已应用于临床,国内组织工程研究,我国开展组织工程研究的领先单位军事医学科学院基础医学研究所中科院化学所高分子物理与化学国家重点实验室中国医学科学院组织工程研究中心 上海组织工程研究中心（“973”组织工程项目首席科学家曹谊林教授领衔）上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室组织工程研究室重庆大学生物工程学院生物力学及组织工程教育部重点实验室暨南大学生物医学工程研究所复旦大学高分子科学系聚合物分子工程教育部重点实验室,1，胚胎干细胞的培养、诱导分化及鉴定 上海等地建立了人类胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞系，建立了诱导分化为成神经 干细胞、成肌肉干细胞、成血管内皮干细胞等技术，为应用胚胎干细胞作为组织 工程种子细胞的来源进行了开创性的工作2，骨髓间质干细胞的分离、纯化及定向分化诱导 北京和上海建立了成年骨髓基质干细胞作为组织工程种子细胞来源的成熟技术体系 3，种子细胞功能老化规律和延缓老化的研究 4，生物材料表面修饰及材料与细胞间亲和性改进的研究 5，生物降解高分子合成、降解速率调控及支架构筑研究 6，组织工程中的生物力学问题 7，组织工程化组织构建研究 上海成功构建组织工程化骨、软骨、肌健、皮肤、角膜基质、血管组织,中国的组织工程学研究进展,成体干细胞组织工程种子细胞的新来源 干细胞的可塑性与干细胞移植的基础研究 成体干细胞的可塑性与受损组织的功能材料外胚间充质干细胞在神经组织工程中的应用自体骨髓干细胞移植在下肢缺血中的应用组织工程种子细胞的大规模培养 用于组织工程的生物反应器及实验装置细胞移植与人工血管生物化 生物力学与组织工程 组织工程的免疫学问题生物力学在功能化组织工程中的应用组织工程皮肤的产业化组织工程骨的产业化思路及组织工程肌腱的产业化思路 开展心肌组织工程和胰岛移植研究提高我国心脏病和糖尿病整体治疗水平 组织工程化周围神经移植体的研究 牙再生相关问题研究,国内组织工程研究,组织工程血管组织工程瓣膜组织工程心肌重建,先天性心脏病 冠状动脉疾病 血管疾病 瓣膜疾病 心肌疾病,心血管疾病组织工程学,研究范围,心脏瓣膜替代物,生物瓣膜,机械瓣膜,血管替代物,Dacron 人工血管,膨体聚四氟乙烯（ePTFE）,自体血管,异体血管,乳内血管大隐静脉,异种血管同种血管,理想的血管移植物,生物血管,人工合成血管,免疫，血栓，感染，钙化,组织工程化血管研究,动脉,静脉,腔大，壁薄，管壁常塌陷中膜平滑肌和弹性组织不发达内弹性膜不明显或缺如部分静脉有静脉瓣,内膜：单层扁平内皮细胞中层：SMC和胶原,正常血管结构,血管细胞外基质成分,胶原非胶原糖蛋白氨基聚糖蛋白聚糖弹性蛋白,血管胶原,，型胶原为主,纤粘连蛋白（FIBRONECTIN）,细胞与基质连接基质与基质连接,在肽链中央的与细胞相结合的模块中存在RGD序列，是细胞表面某些整合素受体识别与结合的部位,氨基聚糖与蛋白聚糖,在心血管基质中主要为 硫酸软骨素 硫酸皮肤素 硫酸乙酰肝素,弹性蛋白（elastin),组织工程化血管,血管组织工程学的目的在体外构建理想的血管移植物 具有高度的组织相容性 可生长性 可塑性 无排异反应 无血栓形成 不易感染 无免疫排异反应 能维持管腔的长期通畅,内皮化人工血管,1986年Jarrell 将获取的ECs接种于 Dacron 1999 年Deusch 等将血管ECs种植于 ePTFE 上 ECs 在材料上长期黏附和存活问题需进 一步改进,以胶原为基础的组织工程血管研究,1986 年Weinberg 从动物体内分离得到的胶 原制成管状网格支架 在支架外套上Dacron 网,再接种成纤维细胞 向管内注入ECs 悬液行旋转培养 建成了类似的肌性动脉,1998年L Heureux 分别用血管SMCs 和人皮肤FB s进行培养细胞和ECM 融合成膜片状物将FB s 膜片套在ePTFE 多孔管轴外,裹上SMCs 膜片;再裹上FB s 膜片待管壁细胞和ECM 成熟后,脱去ePTFE 管轴最后在腔内接种ECs,培育出有生理活性的天然环层结构血管,以细胞膜片技术为基础的血管移植物,该TEBV 的优点为:有生理活性,可自我更新植入后的血管可自行适应体内环境感染率低,机体免疫反应小,远期通畅率高制作设备简单其缺点为:制作周期长,需要3 个月以上,临床应用不便缺乏足够的动物实验及临床观察的依据来判断其在体内的生物学行为 管壁力学强度有待进一步提高,组织工程应用的可降解材料,聚乳酸(polylacticacid，PLA)聚羟基乙酸(polygly-colicacid，PGA)两者的共聚物(PLA/PGA)聚4 羟基丁酸盐（P4HB）聚乙醇酸(PLLA),可吸收材料为支架的TEBV,1998 年,Shinoka 以聚乙二醇酸(PGA)制成管状支架将羊血管细胞种植于支架上,置换相应长度的幼羊主肺动脉的11 周后,支架结构完全消失,管壁内胶原蛋白含量相当于自体肺动脉的73%是一种具有生长、修复功能的活血管 该TEBV 存在以下缺点:PGA 的机械支撑力较弱,用于肺循环尚可,却难以耐 受较高的体循环压力 PGA 过于僵硬,手术缝合性不佳,可吸收材料为支架的TEBV,1999 年,Shum-Tim 用羟化烷烃的聚合物(PHA)的双层管状支架构建了TEBV。内层以有孔的PGA 网作为细胞载体,外层以无孔的PHA 加强机械支撑作用,该TEBV 的血管壁中胶原蛋白到3 个月时占相应自体腹主动脉的25%,5 个月时达99%,内层有平整的内皮细胞,中层有大量的弹力纤维生成,2001 年,Hoerstrup 采用了一种新型可吸收的PGA/P4HB 复合材料通过热焊接技术,制成管形支架采用动态培养.该TEBV 达到了一定的抗张裂强度和缝合固持度,基本符合外科手术的要求,可吸收材料为支架的TEBV,2003年,东京女子医科大学的Matsumura 将骨髓干细胞(BMCs)作为细胞来源制成了TEBV,进行了22 例临床实验,没有发生管道的血栓形成和狭窄以及因该项技术而导致的患者死亡,组织工程血管作为心外管道行全腔静脉肺动脉连接,组织工程血管临床应用,天然生物性材料来源于生物体可分为 大分子无结构材料 如胶原胶、藻酸盐等 去细胞纤维组织材料 脱细胞小肠粘膜下层基质 脱细胞真皮基质 脱细胞血管基质 生物材料提供近似体内组织发生发育的ECM支架条件 植入体内时无或只有极低的免疫排斥反应。血管相容性,顺应性、通畅率等都优于非天然生物 性材料血管,天然生物性材料为支架的TEBV,组织工程血管的发展方向,血管组织工程学仍然处于实验探索阶段,目前TEBV 面临着巨大的挑战:机械强度和弹性:可以承受一定的肺循环压力,体 循环压力难以承受 远期通畅率:小口径(6mm)TEBV 的远期通畅 率仍不理想 TEBV 的顺应性如何能更好的与临近受者血管相匹配,组织工程血管的发展方向,种子细胞来源,目前主要选用各种成熟的功能细胞 再分化能力低 培养生长慢 难以保障功能的完整性胚胎干细胞或骨髓基质干细胞作为种子细胞是今后重要的发展方向,组织工程血管支架/细胞外基质,异种或同种血管组织（如去细胞的猪主动脉，BJVC）是常用的天然生物组织冻存的同种血管已用作冠脉搭桥管道，其缺点是通畅率差和容易形成动脉瘤,天然生物组织,人工高分子可吸收材料 PGA/P4HB 复合材料,组织工程血管的发展方向,细胞与细胞间信号传导 细胞与ECM 相互作用 细胞生长同生长因子间的关系 种子细胞的黏附、迁移、分化、生长研究 生物反应器仿生条件的选择,组织工程学三维培养技术的研究,组织工程血管的发展方向,组织工程心脏瓣膜,需要终身抗凝由于抗凝导致的出血,血栓和感染不能随人体的生长而生长或塑形,较好的血流动力学特点抗感染能力相对较强无需抗凝潜在的免疫原性或鞣制剂抑制宿主自体细胞的生长，导致了生物瓣耐久性差,机 械 瓣,生 物 瓣,人工瓣膜特点,组织工程瓣膜的构建,基本思路,采用人工合成材料、同种或异种的脱细胞心脏瓣膜作为组织工程心脏瓣膜的支架/细胞外基质,通过将体外扩增的患者自体活细胞种植在瓣膜支架上,细胞能够牢固黏附、生长,使其具有正常瓣膜组织的新陈代谢功能,最后应用于置换病变的瓣膜,在体发挥类似于正常瓣膜的功能组织工程心脏瓣膜不仅从功能上发挥正常瓣膜的功能,而且在结构上类似于正常瓣膜,目前被喻为活体生物瓣克服目前所用两类人造心脏瓣膜的缺点,具有非常重要的临床应用前景,理想的瓣膜支架/基质材料须具备特征,良好的生物相容性良好的生物降解性具有三维多孔立体结构良好的可塑性和一定的机械强度良好的细胞-材料界面,基质材料,生物可降解高分子材料,生物可降解高分子材料所制成的瓣膜支架可随着种植细胞外基质的形成,支架逐渐降解、重吸收,被新生瓣膜组织细胞取代,最终在瓣膜组织中不遗留任何异物,因此,它无疑是瓣膜支架的最好选择,聚乳酸(polylacticacid，PLA)聚羟基乙酸(polygly-colicacid，PGA)两者的共聚物(PLA/PGA)聚4 羟基丁酸盐（P4HB）聚乙醇酸(PLLA),消除了抗原性和免疫原性保持正常瓣膜三维空间,纤维网络结构以及可能包含有细胞表面受体的特异性结合位点，有利于细胞种植和生长,并且有很好的抗张强度临床应用前景好,脱细胞处理后的瓣膜支架,优 势,种子细胞来源和种植,目前实验研究所用的细胞来源 动脉或静脉的血管内皮细胞 血管或皮肤的成纤维细胞或平滑肌细胞 骨髓基质干细胞 脐带血干细胞 骨髓基质干细胞应该是最有研究价值 和临床价值的种子细胞来源,先种植成纤维细胞,细胞外基质增加,种植内皮细胞,Steinhoff采用同种去细胞的心脏瓣膜种植自体成肌纤维细胞和内皮细胞 原位肺动脉带瓣管道移植的羊动物模型进行在体功能评价对照组显示瓣膜部分变性，没有瓣膜细胞间质间的重建组织工程瓣显示瓣膜组织的完全重建、内皮细胞充分融合覆盖,组织工程瓣膜动物及临床实验,Hoerstrup 将体外种植、培养的瓣膜置换自体肺动脉瓣术后20周时新生瓣膜的机械特性和自体瓣膜相似,瓣膜的内皮细胞有增殖能力组织学检查发现植入的瓣膜结构与自体瓣膜相似,组织工程瓣膜动物及临床实验,Dohmen 应用体外构建的组织工程瓣 膜植入施行Ross 手术患者的肺动脉瓣 3 个月后心脏超声检查显示瓣膜功能良好 1 例于术后1 年复查,其瓣膜功能优良,无 瓣膜增厚或钙化,组织工程瓣膜动物及临床实验,修复心肌的细胞移植,心力衰竭为临床常见的综合征传统的治疗方法均存在缺陷,寻求一种新的更好的治疗手段已成为目前临床的迫切需求之一,研究背景,各种原因所致心力衰竭的共同特点是具有完全舒缩 功能的心肌细胞数量减少 增加具有完善收缩功能的心肌细胞数目应该是有 效地治疗心肌损伤的关键 细胞心肌移植，为修复心肌损伤开辟了一条全新 的途径,研究背景,将某种来源的干细胞通过细胞移植的方法种植到病变区域，使其增生分化为心肌细胞，从而达到增加和恢复具有完善收缩功能心肌细胞的数目，逆转心肌重塑，改善心功能，防治心力衰竭的目的,心肌细胞移植,肌源性细胞 心肌细胞 骨骼肌成肌细胞 平滑肌细胞 非肌源性细胞 成纤维细胞 肝脏来源的干细胞 血管内皮细胞 胚胎干细胞 骨髓多能干细胞 骨髓造血干细胞 骨髓基质细胞 骨髓内皮祖细胞 骨髓单个核细胞,细胞来源,移植方式,心外膜局部肌肉注射 心内膜局部肌肉注射 外周静脉注射 冠状动脉内注射 冠状静脉窦内注射,SPECT,细胞移植效果,细胞移植前,细胞移植后,细胞移植作用的可能机制,分泌生长因子，促进侧枝循环形成，改善了心梗区灌注 心肌细胞的凋亡减轻，受损心肌细胞得以修复长期存活 使心梗区室壁弹性增加，减轻了心肌张力 移植细胞直接参与收缩，改善心功能 减少胶原沉积，限制瘢痕组织扩大,需解决的问题,细胞来源的选择 移植的指征 移植时机 方法及数目 疗效的合理评价 作用机制,生物反应器是用来进行生物或/和生物化学反应 的一种装置其内部环境及操作条件将受到严格控制和监测，如PH，温度，压力，营养供应和废物排出等生物反应器是组织工程产品从实验研究到大规模 应用的关键,生物反应器 Bioreactor,生物反应器已广泛应用于多个领域:工业发酵处理 废水处理 食品处理 药物生产 蛋白质重组（生长因子等）,组织工程研究应用的生物反应器的类型,A 微控搅拌式反应器B 壁旋转式反应器C 中空纤维反应器D 直接灌注式反应器E 机械刺激生物反应器,Experimental hollow fibre bioreactor,Prototype bi-axial rotating-bioreactor system,双轴旋转的生物反应器系统样机,Associate Professor Low Hong Tong in Singapore,Rotating wall bioreactor instrumented with probes to quantify mass transport.,UK centre,ITEMS BioReactor(Intelligent Tissue Engineering via Mechanical Stimulation),机械刺激智能生物反应器,ITEMS生物反应器的设计特征,人性化外观特征 生物反应器设计紧凑，能置于中等大小的有利于控制温度，湿度和环境的孵化系统中 生物反应室和动力泵由钛，不锈钢，树酯和玻璃构成，耐久性好 独立装置设计减少污染，有利于实验在营养环境下进行 反应腔为标准设计，支架旋转细胞种植，且不依赖刺激系统 反应腔为高度透明设计，以利于构建物的直接观察，它还使得营养液在血管构建物内外分别流动,什么叫组织工程学 心血管组织工程学种子细胞有哪些 生物可降解材料有哪些 目前组织工程血管要解决的主要问题 组织工程瓣膜支架有哪些 心肌细胞移植 生物反应器（bioreactor),课程评价,结 语,组织工程学将为心血管疾病的治疗 带来全新的机遇和挑战 组织工程学研究正在加速发展 组织工程学研究需要多学科人员通力合作 组织工程学需要政府支持，加大投入,