《组织培养》PPT课件.ppt

Chapter 3 培养基,培养基的成分培养基的配制培养基的筛选,培养基(culture medium)的配制是组培工作的核心。外植体之所以能沿着不同的组培途径生长、分化，其主要原因就在于培养基中的物质成分对细胞的生长发育起着定向调控作用。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。,事实上，培养基的研制始终伴随着组培技术的发展，整个组培的发展史就是一部培养基的研制史：1902 Haberlandt knop培养液Suc 失败 1934 White 等人 无机有机（VB）IAA 脱分化 1957 Skoog&Miller CYT/IAA 激素调控 再分化 1958 Steward 首次实现植株再生 里程碑 1965 Vasil 成分已知的合成培养基 单Cell 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。,一、培养基种类,各种培养基都是建立在White和Gautheret培养基基础之上的。培养基数目之多到无法统计的地步。常用培养基不下几十种。,二、培养基特点,1.MS培养基：无机盐和离子浓度较高，比较稳定的离子平衡溶液。养分数量和比例较合适，硝酸盐含量较其他培养基高，广泛应用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养。2.B5培养基：含有较低的铵，这个成分可能对不少培养物生长有抑制作用，双子叶特别是木本植物适合于B5培养基。,3.White：无机盐数量较低，适合于生根培养。4.NT培养基：适合于烟草叶肉原生质体培养。5.KM-8P培养基：有机成分较复杂，包括了所有的单糖和纤维素、呼吸代谢中的主要有机酸。广泛应用于原生质体和细胞融合的研究。6.N6培养基：成分较简单，且KNO3和(NH4)2SO4含量高，应用于花药培养和组织培养。,三、培养基成分,1、基本培养基：提供组织生长的基础营养物质。基本培养基无机有机2、培养基的成分：培养基=无机有机激素固化剂其它,1）无机成分大量元素（0.5mmol/L 或 100mg/L）:N、P、K、Ca、Mg、S；微量元素（0.5mmol/L 或 100mg/L）:铁(Fe)、硼(B)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)、钴(Co)、氯(Cl)。,2）有机成分,有机成分（organic compound）：指植物生长发育时必需的有机碳、氢、氮等物质。主要有糖、维生素、肌醇、氨基酸等。,糖（sugar）,糖既可作为碳源，为培养的外植体提供生长发育所需的碳骨架和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用。常用蔗糖，浓度为15%。,维生素（vitamin）,维生素类化合物在植物细胞里主要以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。使用量通常为0.11.0mg/L。,肌醇（inositol）,肌醇能帮助活性物质发挥作用，使培养组织快速生长，促进胚状体及芽的形成。用量一般为50100mg/L。,氨基酸及有机添加物（amino acid and organic addition）,一种重要的有机氮源，除构成生物大分子的基本组成外，还具有缓冲作用和调节培养物体内平衡的功能，对外植体芽、根、胚状体的生长、分化有良好的促进作用。,天然复合物,大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。由于成分复杂，实验可重复性差，应尽量不用或少用。但有时大胆启用此类物质可能起到意想不到的效果。常用的有：CH（水解酪蛋白）、CM（椰子汁）、ME（麦芽浸提物）、YE（酵母浸提物）、TJ（番茄汁）、香蕉、马铃薯,1)椰乳（CM）是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1nun时，椰乳就不发生作用。2)香蕉（banana）用量为150-200mlL。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。3)马铃薯(potato)去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150200gL。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。4)水解酪蛋白（CH）为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100200mgL。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,实验设想：目前已经组培成功的植物只有4000余种，对一些难于培养的植物种类，可否将其组织捣碎，分离汁液作为培养基的添加剂，以其有所突破？,3）植物生长调节物质（plant growth regulator）,对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化，起重要和明显的调节作用。,生长素类（auxin）,促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导愈伤组织形成，促进生根。常用生长素有IAA、NAA、IBA和2,4-D，作用强弱依次为2,4-DNAAIBAIAA。,细胞分裂素（cytokinin）,促进细胞分裂，抑制衰老，由愈伤组织或器官上分化不定芽。常用的细胞分裂素有激动素(KT)、异戊烯基腺嘌呤(2iP)、6-苄基腺嘌呤(BAP)、玉米素(Zt)、噻重氮苯基脲(TDZ)，作用强弱依次为TDZZt2iPBAPKT。,其他类,除了生长素和细胞分裂素外，赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、多效唑（PP333）和乙烯类等。,4）其他附加物,琼脂：使培养基固化，防止培养物浸入培养液中导致缺氧而死亡。使用浓度一般为0.61%。活性炭：吸附有毒、有害的化合物。,5）pH值,培养基的pH值在高温高压灭菌前一般调至5.06.0，pH值高于6.0时，培养基会变硬，低于5.0时，琼脂凝固效果不好。,四、培养基的选择,培养基基本培养基 植物激素（物质基础）（调控手段）生存 发展 培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合，实现离体细胞的生长、分化与植株再生。而最佳组合的结论作出，需研制培养基配方并试验其效果。,在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基的物质种类、用量、比例关系作出适当调整后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基。选择最佳培养基，常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。,1、单因子试验 在试验中，培养基中其他成分都维持在一般水平上，只变动一个因子，通过试验可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。,例：以MS为基本培养基，分别对BA和NAA作单因子分析：MSBA2NAAm（0.1、0.5、1.0）MS+BAn+NAA0.1（0.5、1.0、2.0）局限性：探索范围难于把握，不能反映各种单因子成分之间的组合效果与相互影响。,2、多因子试验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验。试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案。完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合。例如研究NAA和6-BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验。,2种激素5种浓度的实验组合,完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用L9表时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，其结果相当于做了27次种搭配的试验。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。,例如：A、B、C、D四个变动因子，各有1、2、3三种不同水平，则可如图设计实验：对结果进行方差分析与显著性分析即可了解4种不同因子的影响力。,3、逐步添加和逐步排除的试验方法：在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。,4、广谱实验法 在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。,科学安排研究顺序：基本培养基的选择：通常会以一种或几种已知的基本培养基为起点，通过实验确定出合适的营养物质水平。激素配比的选择：通过单因子分析、多因子实验、正交实验等方法确定出最佳激素配比模式。,糖浓度的选取：大多数植物2或3，少数4；花药培养时糖浓度要求较高，715，其主要作用在于调节基质渗透压。PH值的选取：植物组织对PH值要求不高，一般，个别喜酸或喜碱，可结合植物的生长习性适当调整，也可通过单因子分析加以确定。,5、综合因子的确定：在各个单项因子的条件找到以后，综合进行全面实验，并根据实验情况作出适当调整，即可确定出最佳培养基配方。,五、培养基的制备,1.母液的配制,优点：1）可减少每次配制称量药品的麻烦；2）减少极微量药品在每次称量时造成的误差。,（1）大量元素混合母液,配制成10倍的母液1）各化合物必须充分溶解后才能混合；2）混合时注意先后顺序，特别要将Ca2+、Mn2+、Ba2+和SO42-、PO43-错开，以免产生沉淀。3）混合时要慢，边搅拌边混合。,（2）微量元素混合母液,除了Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等盐类的混合溶液，因含量低，一般配制成100倍，也要注意顺序溶解后再混合，以免沉淀。,（3）铁盐母液,将FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分别置于450ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解，然后将2种溶液混合，把pH调到5.5，加蒸馏水至1L，可配成100倍或200倍母液。,（4）有机化合物母液,主要是维生素和氨基酸类物质，可配制成100或200。,（5）植物激素,每种激素必须单独配制成母液，浓度为每毫升含0.1、0.5、1.0mg激素，用时根据需要取用，激素一般浓度表示方法为mg/ml。,2.培养基的配制,1）融化琼脂 称出规定数量的琼脂和蔗糖，加水到培养基最终体积的2/3，加热使之溶解。2）混合培养基中各成分，依次加入大量、微量、铁盐和有机成分。3）加蒸馏水至培养基的最终容积。4）用pH计或pH试纸测pH值，并用0.1mol/LHCl或NaOH进行调节。,5）分装 将配制好的培养基分装于培养容器内，并用棉筛或封口膜封好瓶口。6）灭菌 用高温高压灭菌，一般在121下灭菌1520min。7）放置备用 使培养基在室温下冷却，置冰箱中4保存。,Chapter 4 外植体,植物体的各个部位，如根、茎、叶、花瓣、花药、胚珠、块茎、茎尖、维管组织、髓部等。植物种类不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理状态，对外界诱导反应能力及分化再生能力不同。,一、外植体种类,1、植物基因型,植物基因型不同，组织培养的难易程度不同，草本植物比木本植物易于通过组织培养获得成功，双子叶植物比单子叶植物易于组织培养。选择适宜的外植物，首先要对材料的选择有明确的目的，选取优良的或特殊的具有一定代表性的基因型，这样可提高成功率，增加其实用价值。,2、外植体来源,从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作外植体，离体培养易于成功。同一植物不同部位之间的再生能力差别较大。最好对所要培养的植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选合适的、最易再生的部位作为最佳外植体。茎尖是较好的外植体。,3、外植体大小,外植体的大小，应根据培养目的而定。外植体过大，杀菌不彻底，易于污染；过小，离体培养难于成活。一般外植体大小在0.51.0cm为宜。,4、取材季节,离体培养的外植体最好在植物生长的最适时期取材，即在其生长开始的季节采样，若在生长末期或已经进入休眠期取样，则外植体会对诱导反应迟钝或无反应。,5、外植体的生理状态和发育年龄,外植体的生理状态和发育年龄直接影响离体培养过程中的形态发生。一般情况下，越幼嫩，年限越短的组织具有较高的形态发生能力，组织培养越易成功。,（1）选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。,材料选取的原则,（2）选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织；要在晴天，最好是中午或下午取材料，绝不要在雨天、阴天或露水未干时取样。因为健壮的植株和晴天光合呼吸代谢旺盛的组织有自身消毒作用，再生能力强，比较容易培养成功。,（3）选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高；花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。,（4）选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm 1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。,（5）选取适宜的消毒剂 完全地杀死材料表面的微生物，表面消毒的基本要求是既要杀死材料表面全部微生物，又要不伤害材料，选用适当的消毒剂、合适的浓度和处理时间，灵活掌握和使用。,二、外植体接种,外植体接种（explant inoculation）：是把经过表面消毒后的植物材料在超净工作台上切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它 们转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。,外植体接种操作,1）入无菌室前要用肥皂洗手，去掉指甲中污物；2）入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩、鞋子等；,3）操作前要用70%酒精擦洗工作人员手，操作中要经常用70%酒精擦手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。,4）在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，必须在酒精灯火焰处进行操作，可在打开前用火焰烧瓶口，盖瓶盖前将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到 足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。,5）每次重新操作前都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。6）工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。,7）由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。,三、培养条件,接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。,1、光照 通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000 lx-5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。,2、温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所用的温度是25C2C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。,3、湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。,4、氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。,四、外植体褐变,1、概念 褐变（browning）是指外植体在培养过程中，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。,褐变包括酶促褐变和非酶促褐变，一般主要是酶促褐变引起的。由于多酚氧化酶催化酚类化合物形成醌和水，醌再经非酶促聚合，因而形成深色物质，对外植体产生毒害。,2、褐变的原因,1）植物种类及基因型 不同种植物、同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。木本植物一般比草本植物容易发生褐变。2）外植体部位及生理状态 外植体部位及生理状态不同，接种后褐变的程度不同。幼龄材料一般比成龄材料褐变轻；取材时期不同，褐变程度不同。,3、褐变的影响因素,3）外植体受伤害程度 外植体受伤害程度可影响褐变，化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变。4）培养基成分及培养条件 初代培养时，培养基中无机盐浓度过高可导致外植体褐变；激素使用不当，也会使组织培养材料褐变；培养基中的高pH明显加重褐变；培养条件不适加速褐变。5）培养时间过长,4、褐变的预防,1）选择适当的外植体2）对外植体进行预处理3）选择适宜的培养基和培养条件4）添加褐变抑制剂和吸附剂5）连续转移,五、外植体的玻璃化现象及其预防措施,玻璃化是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的现象。,1、现象,2、玻璃化苗的危害性,由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。,3、玻璃化的原因,玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。,（1）激素浓度 激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。,（2）琼脂浓度 培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。因此，琼脂的浓度一定要适当。,（3）温度 适宜的温度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低玻璃化苗的比例越高。温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。,（4）光照时间 不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在10h12h光照下都能生长良好，光照时数大于15h时，玻璃化苗的比例明显增加。,（5）通风条件 试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。在一定容量的培养瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。如果培养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。,（6）离子水平 植物生长需要一定的矿物质营养，但是，如果营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。,4、预防玻璃化的措施,（1）适当控制培养基中无机营养成分 大多数植物在MS培养基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于MS培养基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例。,（2）适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度 适当提高培养基中蔗糖的含量，可降低培养基中的渗透势，减少外植体从培养基中可获得的水分；而适当提高培养基中琼脂的含量，可降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，也可降低玻璃化，如将琼脂浓度提高到1.1%时，洋蓟的玻璃化苗完全消失。,（3）适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度 细胞分裂素和赤霉素可以促进芽的分化，但是为了防止玻璃化现象，应适当减少其用量，或增加生长素的比例。在继代培养时，要逐步减少细胞分裂素的含量。,（4）增加自然光照，控制光照时间 在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不宜太长，大多数植物以8h 12h为宜；光照强度在1000lx1800lx之间，就此可以满足植物生长的要求。,（5）控制好温度 培养温度要适宜植物的正常生长发育。如果培养室的温度过低，应采取增温措施。热击处理，可防治玻璃化的发生。如用400C热击处理瑞香愈伤组织培养物可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。,（6）改善培养器皿的气体交换状况 如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。,（7）在培养基中添加其它物质 在培养基中加入间苯三酚或根皮苷或其它添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化。,添加马铃薯法可降低油菜的玻璃苗的产生频率；用0.5mg/L多效唑或10mg/L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；添加1.5g/L2.5g/L的聚乙烯醇也成为防治苹果砧木玻璃化的措施；在培养基中加入0.3%的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。,例如：,六、继代培养,1.概念 继代培养（subculture）：组织培养中，培养物培养一段时间后，为了防止培养的细胞团老化，或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累毒害等的影响，将其及时转移到新鲜培养基中的过程就是,继代培养时间的长短因植物材料不同、培养方法和实验目的的不同而不同。一般液体培养的继代时间短，1周左右继代1次；固体培养继代时间长些，24周继代1次。,2、体细胞无性系变异,体细胞无性系变异（somaclonal variation）可能的原因：从细胞水平上发现，体细胞培养的植株染色体数目和结构发生改变，引起基因 重排，产生多倍体和非整倍体。染色体缺失、倒位、易位、断裂等都是在细胞水平上导致无性系变异的重要因素；,从分子水平上推测，可能是由于遗传物质的分子结构发生了变化，引起了跳跃基因的出现，基因重排、基因扩增或减少、DNA排列顺序发生变化等。,七、试管苗的驯化与移栽,1、试管苗生长的特点 1）试管苗的生态环境 组织培养中培育出来的苗通常称试管苗或组培苗。由于试管苗长期生长在试管或三角瓶等培养器皿中，与外界环境隔离，形成了一个独特的生态系统。这个生态系统与外界环境条件相比具有以下4大差异，即高温、高湿、弱光和无菌。,（1）高温且恒温 在植物试管苗整个生长过程中，通常均采用恒温培养，即使某一阶段稍有变动，温差也是极小的；并且在培养过程中，通常温度控制在252，有的植物需将温度控制得更高；而外界环境条件，温度处于不断变化之中，温度的调节完全是由自然界太阳辐射的日辐射量决定的，温差很大，而且一般不会达到25 2。,（2）高湿 植物组织培养中试管或培养瓶内的水分移动有2条途径，一是试管苗吸收的水分，从叶面气孔蒸腾；二是培养基向外蒸发，而后水汽凝结又进入培养基。这种循环就是培养瓶内的水分循环，其循环的结果造成培养瓶内空气的相对湿度接近于100，远远大于培养瓶外的空气湿度，所以试管苗的蒸腾量极小。可见培养瓶内的水分状态直接影响着试管苗的生长和各种生理活性。,（3）弱光 组织培养中的光强与太阳光相比一般很弱，故幼苗一般生长也较弱，经受不了太阳光的直接照射。,（4）无菌 试管苗所在环境的另一大特点是无菌。不仅培养基无菌，而且试管苗也无菌。在移栽过程中试管苗要经历由无菌向有菌的转换。这一点若不注意，也会引起试管苗移栽过程中的死亡。另外，试管苗还处在一种特殊的气体环境中。以上这些特点都决定了试管苗移栽前持的环境条件与移栽后的外界环境条件有极大的差异，只有有效地使试管苗适应这种差异，才能使之移栽成活，因而这就需要试管苗有一定的驯化时期。,2、试管苗的特点 试管苗与常规苗相比具有如下特点：第1，试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达；第2，试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用功能较差；第3，试管苗的叶片气孔数目少，活性差；第4，试管苗根的吸收功能弱。,3、试管苗的驯化 驯化的目的：在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。,驯化的原则：应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。,驯化的方法：驯化一般在试管苗移栽前进行，首先进行移栽前的驯化锻炼即练苗，其具体方法是将长有完整试管苗的试管或三角瓶由培养室转移到半遮荫的自然光下进行锻炼，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度，并打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相似。驯化一般进行12周。,4、试管苗的移栽 试管苗的移栽往往和驯化同步。移栽的方法有：常规移栽法、直接移栽法和嫁接移栽法。,（1）常规移栽法 常规移栽法是指将试管苗在生长素浓度高的培养基上诱导生根，当获得大量的不定根后，打开培养瓶注入少量自来水，在半遮光下驯化3d5d，然后取出洗去培养基，移栽到无菌的混合土（如沙子：蛭石=1：1）中，保持一定的温度和水分，当长出23片新叶时就可将其移栽到田间或盆钵的方法。,（2）直接移栽法 直接移栽法是指直接将试管苗移栽到盆钵的方法。,（3）嫁接移栽法 嫁接移栽法是指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。据王连清等人对棉花的试管苗进行嫁接移栽的有关试验表明，试管苗的嫁接移栽法与常规移栽法相比具有许多优点，其最主要的有以下几点：,表4-1 嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果,5、影响试管苗移栽成活率的因素 影响试管苗移栽成活率的因素有许多种，包括内因与外因。不同的植物和不同的试管苗种类对移栽的具体要求是不同的。总的来说，提高试管苗移栽成活率的途径有以下几种。,（1）试管苗的生理状况（选择壮苗）试管苗的生理状况是影响移栽成活率的内在因素。同一种植物的试管苗，其壮苗比弱苗移栽后成活率高（如表4-1）。,（2）植物生长调节物质 一般来说生长素因为能促进生根，故也能提高试管苗移栽的成活率。但是，不同的植物有其适宜的生长素种类。如在月季的试验中发现，以NAA诱导生根和提高移栽成活率效果最好；而IAA并不理想，当IAA的浓度超过1mg/L时，反而急剧降低移栽成活率。,细胞分裂素一般会抑制根的生长，不利于移栽。如在月季的试验中表明，无论是BA或2-ip对生根和移栽都有抑制效应，即使在很低的浓度下也可发现。,（3）无机盐浓度 试验结果表明，降低无机盐的浓度对植物生根效果较好，有利于移栽成功。,（4）活性炭 在生根培养基中加入少许活性炭，对某些月季的嫩茎生根有良好作用，尤其是采用酸、碱和有机溶剂洗过的活性炭，效果更佳。但活性炭对有些月季品种的促根生长无反应。,（5）环境因子 环境条件也影响试管苗移栽的效果，关键是控制好移栽前10d的光、温、湿。做好适当遮荫工作，避免太阳光直射，造成试管苗迅速失水而死亡。温度一般保持在2530 为好。开始几天最好用烧杯罩住移栽苗，使其周围的相对湿度保持在85%以上。,（6）移栽过程中让试管苗从无菌向有菌逐渐过渡 试管苗出管后，要将其上面的培养基洗净，以免杂菌滋长。对于移栽后成活比较困难的植物，第一次移栽时最好选用灭菌过的基质，以提高其移栽成活率。,