《相对定量分析》PPT课件.ppt

,荧光定量PCR应用,相对定量胡顺磊,2,相对定量的原理相对定量实验的分析方法相对定量实验设计总结,3,PCR定量实验 概述,相对定量,4,相对定量PCR实验目的和要求,相对定量实验的目的是用于研究样本中某个或某些核酸表达水平的差异。优点：能够检测目的基因“量”的细微变化 长期实验及不同实验体系中所得数据能够进行比较,5,相对定量原理(I),利用内参基因(=内源性对照)对样本间的差异进行归一化处理,Step 1:相同样品中的目标基因和参比基因的浓度Step 2:不同样品中目的基因的含量差别由参比基因校正,参比基因可以修正：样品起始量的差别样品中核酸回收率的差别样品中可能的RNA降解不同样品中核酸质量的差别加样差,参比基因的选择,理想的参比基因:表达水平在所有样品中是持续、稳定的：正常组织 vs.肿瘤组织表达水平不受实验条件变化的影响：处理样本 vs.未处理的样本看家基因(Housekeeping genes)：编码有基础细胞功能的蛋白质,7,Reference Gene Selection,Normalization of gene expression measurements in tumor tissues:comparison of 13 endogenous control genesde Kok JB,Roelofs RW,Giesendorf BA,Pennings JL,Waas ET,Feuth T,Swinkels DW,Span PN.Lab Invest.2005 85(1):154-159Reference genes identified in SH-SY5Y cells using custom-made gene arrays with validation by qPCRHoerndli FJ,Toigo M,Schild A,Gotz J,Day PJ.Anal Biochem.2004 335(1):30-41Determination of an internal control to apply reverse transcription quantitative PCR to study stress response in the lactic acid bacterium Oenococcus oeni.Desroche N,Beltramo C,Guzzo J.J Microbiol Methods.2005 60(3):325-33.Evaluation of potential reference genes in real-time RT-PCR studies of Atlantic salmon.Olsvik PA,Lie KK,Jordal AE,Nilsen TO,Hordvik I.BMC Mol Biol.2005 Nov 17;6:21.Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in bovine preimplantation embryos.Goossens K,Van Poucke M,Van Soom A,Vandesompele J,Van Zeveren A,Peelman LJ.BMC Dev Biol.2005 5:27.,使用校准品样本(calibrator)对最终分析结果进行进一步的均一化校准同次实验中目的基因与参比基因的检测灵敏度校正不同次实验间 run to run&不同试剂批号lot to lot 差异,相对定量原理(II),校准品样本：未处理的细胞系起始时间点的样本 正常组织样本,9,相对定量的原理 相对定量实验的分析方法相对定量实验设计总结,相对定量常规的两种分析模式,相对定量(以校正样本归一化处理),精确值=带扩增效率校正-method,近似值=没有扩增效率校正 CT 法,全部假设:E=2,相对定量计算公式=2-CT,相对定量计算公式=ET CpT(C)-CpT(S)X ER CpR(S)-CpR(C),校正目标基因和内参基因 实际上不同的扩增效率,11,PCR 定量实验,E,N=No x ECp,相对定量结果的计算方法,EFFICIENCY 扩增效率ET=ER=2?,相对定量方法(1)Cp 法,默认扩增效率 E=2，(-Cp)方法Calibrator Normalized Ratio=2CpT(C)CpT(S)x 2CpR(S)CpR(C)=2CpT(C)-CpR(C)-CpT(S)-CpR(S)=2Cp(C)-Cp(S)=2-Cp,相对定量方法(1)Cp 法,该方法假设：目标基因和内参基因的PCR扩增效率相同扩增过程在整个PCR反应中保持恒定不变(E=2)归一化的相对比率=2-Cp无需标准曲线,PCR 扩增效率的影响因素,目标基因和内参基因之间的PCR效率差异是由于:探针复性的差异染料淬灭系数的差异荧光共振能量传递效应（FRET）的效率差异cDNA合成效率的差异目标基因与内参基因之间的PCR效率差异会造成实验的显著误差当前有且仅有LightCycler相对定量软件的独特算法可对效率差异进行校正,实际上不是所有的PCR反应都能达到E2的理想扩增效率不是所有的PCR反应在整个过程中的扩增效率都保持恒定,PCR 扩增效率,PCR 扩增效率的差异存在于：不同模板及引物序列的差异不同的PCR体系不同次的PCR实验N=No x En,E=2?理想情况下扩增效率2,17,PCR 扩增效率的计算,E=10-1/slope,相对定量方法(2)-Method,通过标准曲线对扩增效率修正标准曲线对样品做梯度稀释不需要已知样品浓度,最为准确的相对定量结果,相对定量方法(2)-Method,扩增效率的校正显著降低了计算中的误差-Method 是罗氏诊断的独有算法，采用产物的实际扩增效率数值计算定量结果,校准样本校准后的浓度比=ET CpT(C)-CpT(S)X ER CpR(S)-CpR(C),20,相对定量的原理相对定量实验的分析方法LightCycler Software操作相对定量实验设计总结,21,LightCycler 480 Software 1.5相对定量-分析模块,两种不同的分析方法:简单相对定量分析:简洁/自动,结果通过一键即可自动计算 获得高级相对定量分析:根据您的需要，提供更为灵活且可靠的 分析结果,22,LightCycler 480 Software 1.5初始界面-New Experiment from Template,Select appropriate run protocole.g.,for detection of FAM“Mono Color Hydrolysis Probe-UPL Probe”,23,LightCycler 480 Software 1.5Sample Editor,Table or Plate ViewStep 1:Select Workflow and Filter CombinationStep 2:Select SamplesStep 3:Enter properties and define identifiers,24,自动配对:分析软件可以根据Sample Editor中样本的名字进行目的基因和内参基因的配对,LightCycler 480 Software 1.5相对定量实验涉及到的标识,25,简单相对定量分析With One Click to Results,26,简单相对定量分析注意事项,简单相对定量分析模式默认是将整板的孔信息进行分析（将未使用的孔设置为Unassigned）简单相对定量分析模式默人使用 Fit Points method 计算 Cp 值，因此可能需要进行Noise Band 的设定。,点选 Target Name:激活所指定的 target点击Show Abs Quant调整 Noise Band点击 Calculate点击 Back to Rel Quant,27,高级相对定两分析可以根据您的需要进行更多灵活的分析,28,高级相对定量分析结果 柱状图,29,高级相对定量分析手动配对,30,相对定两分析软件中的Factors,OptionalMultiplication Factor:A multiplication factor might be used to adjust the final calibrator-normalized relative ratios to a reasonable value(“cosmetic”function for easier reading and interpretation of results).Correction Factor:A factor that is used to normalize for lot-to-lot differences of the calibrator.Each new batch of the calibrator has to be validated with a“master“calibrator.,31,高级相对定量分析Target Name,选中目的基因的名字然后点击Show Abs Quant 查看并调整相关基因的扩增结果Crossing Points ResultsReplicate StatisticsDisplayEfficiency,32,高级相对定量分析Results-Sample View,33,高级相对定量分析Result-Settings,34,LightCycler 480 Software 1.5 Report,35,相对定两分析模块Basic and Advanced:Analysis Options,36,相对定量的原理 相对定量实验的分析方法相对定量实验设计总结,37,相对定量 实验设计-主要因素,1.实验设计确定研究的目的基因 选定合适的内参基因（最好能多选取几个）优化反应条件 选择合适的样本及样本制备方法(包括对照样本的选取)2.实验验证确定实验的效果(动态范围&效率)3.分析方法的选择简单相对定量分析高级相对定量分析,38,一步法 or 二步法 RT-PCR,One-Step RT-PCR:逆转录&PCR扩增过程一次完成操作简单污染几率低快速引物的特异性要求高 Two-Step RT-PCR:逆转录和PCR扩增分别完成不同的引物选择(oligo dT,random hexamers,specific)cDNA便于长期保存,39,目的基因&内参基因扩增方式的设计,目的基因和内参基因分别在不同的反应管中扩增 表达水平差异很大目的基因和内参基因通过不同的run扩增 PCR反应程序不同 不同的检测模式(e.g.SYBR Green I)and reference(e.g.HybProbe format)目的基因和内参基因进行多重PCR扩增(dual color)多重荧光扩增会降低动力学范围 比较单色扩增和双色扩增时目的基因与内参基因的动力学范围,40,Calibrator Normalized Relative Quantification 设置,无扩增效率校正(E=2):简单方法有扩增效率校正:高级相对定量 双标法,效率,影响因子,Determination of a correction factor and/or a multiplication factor,单色(目的基因和内参基因在不同的反应管或反应孔)双色(目的基因和内参基因在同一个的反应管或反应孔)flexible Pairing“of target and reference samples(multiple housekeeping genes),反应的设置,校准样本,选择合适的校准样本,41,LightCycler 相对定量分析Workflow,Established LightCycler PCR for target and reference gene,Determination of a calibrator,LC run with samples and calibrator(target/reference),Analysis,Basic,Advanced,42,相对定量实验设计Workflow Example(1),1.Experiment Design Identification of the target gene(s)of interest and suitable reference gene(s)e.g.:target 1,target 2housekeeping gene(HK)1,housekeeping gene(HK)2Optimization of reaction conditionse.g.:use LightCycler 480 Probes Master together with UPL probe and primersselect the appropriate run protocol(make use of“New Experiment from Template”)Selection and preparation of sample material,including a calibrator samplee.g.:untreated sample(=calibrator)5 samples treated with different agents always include a NTCstart with cDNA prepared by Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(2-step RT-PCR)Set up experimente.g.:monocolor reactiontarget and HK PCR on one MWP,43,Relative Quantification Assay Set Up Workflow Example(2),2.Experiment ValidationDetermination of assay quality(dynamic range&efficiency)for each target and each reference gene,3.Method Selection for AnalysisBasic Analysisfast tracking solution for well performing assaysconvenient CT MethodAdvanced Analysishigh confidence solution for most challenging assays!particular E-Method benefit of standard curves(linear,non-linear standard curve fitting;fixed dynamic range)benefit of in-run standard(inter-assay calibration),44,相对定量的原理相对定量实验的分析方法LightCycler Software操作相对定量实验设计总结,45,通过内参基因均一化 校正不同样本来源核酸质量及含量的差异通过校准样品均一化 校正不同实验批次以及不同试剂批号之间的差异扩增效率的考量无扩增效率的校正 E=2in case PCR efficiencies of target and reference are different and E2 edit E valuestandard curves in run or import of standard curve objectslinear or non-linear standard curve(fit depending on data),相对定量软件的特点及优势,46,相对定量分析方法 流程,combinable as template,47,LightCycler 480 Software,Version 1.5 相对定量分析方法 比较,48,Terminology Used in Different Software Summary,Doing now what patients need next,50,Types of Quantification,Real-Time PCR Quantification Principles,Absolute Quantification,Relative Quantification,External Standards(monocolor),ExternalStandards(without calibrator),Calibrator-Normalized Method,withoutEfficiency Correction(CT)-Method,withEfficiency Correction(-Method),External Standards with Internal Control(dual-color),