《基因工程载体》PPT课件.ppt

基因工程载体,Made by lionchp,一 分类,依功能：克隆载体、表达载体、转录载体克隆、表达的基本流程：克隆载体 转录载体DNA DNA RNA 蛋白质 表达载体,依组成：质粒、噬菌体、病毒、粘性载体、人工染色体可承载基因量：依次增大,依类型：原核载体：质粒、噬菌体真核载体：酵母、病毒两类载体分泌型载体：传导入受体细胞后，表达产生 蛋白产物释放出来的载体穿梭载体：传导入受体细胞后，可在各细胞 间传递的载体,二 要求,可独立复制：有复制子含多个酶切位点：利于双酶切含抗性标记基因：利于重组体筛选质量数小：可接合外源DNA的量大,三 结构组成,复制区：一个载体就是一个复制子启动子：基因可表达标志基因（例如抗药基因）：标志基因的作用：,四 质粒载体,结构：cccDNA（闭合、环状、共价）分类：根据复制类型严紧型：一个细菌中不能有过多的该种质粒松弛型：一个细菌中可有多个该种质粒（20个）根据移动性（接合性）转移型（接合型）：可通过性菌毛进入另一细菌非转移型（非接合型）：不可通过性菌毛进入另一 细菌,根据作用F质粒：R质粒：Col质粒：,命名：PBR322为例P：质粒BR：发现、构建该质粒的实验室/作者名首字 母简写322：该质粒的实验编号,特征：一个质粒就是一个复制子不相容性：有相同复制起点和分配区的质 粒不能共存于一个宿主细胞中,几种常见的质粒载体PBR322：,PUC18/19：,PGEM-3Z：,PGEM-4Z：,标志基因的应用,双酶切方法：用两种不同的内切酶分别切目的片段 与载体，各自得到两个不同的黏性末 端作用：目的片段可按顺序接合到载体上，单 酶切的载体两边是两个相同的黏性末 端，目的片段结合到载体上的顺序不 确定,抗性筛选插入失活：目的基因插入载体时，插入到载 体的标记基因当中，破坏了该基 因，使此载体失去对应的抗性应避免插入失活的原因：不插入失活时，培养的细胞菌落培养基中加入一种抗生素（载体上有对应抗性基因），能继续生长的菌落为阳性克隆，即我们要的菌落,插入失活后的筛选：影印法培养细胞（A、B两个培养基中菌落位置分别相等），A中加入A抗生素，B中加入B抗生素筛选出有A、B两抗性基因，但A被插入失活的重组载体：A中的且B中不死的菌落为阳性克 隆，即我们要的菌落,蓝白斑筛选原理：IPTG诱导LacZ（乳糖操纵子中）表 达出的酶可与X-gal成蓝色吲哚产物互补：载体上有片段，菌体基因组中有LacZ（LacZ缺片段），阳性克隆菌便有完整LacZ，可加IPTG诱导产生酶，加X-gal成蓝色吲哚产物蓝斑，阴性克隆菌成白斑,五 噬菌体载体,噬菌体载体：M130噬菌体载体：,六 黏性载体,七 病毒载体,八 人工染色体,细菌人工染色体：,酵母人工染色体,本章总结,