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基因工程,基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,一、DNA重组技术的基本工具,准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）限制酶DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）DNA连接酶基因转移工具（“分子运输车”）运载体,1、限制酶 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,EcoR,黏性末端,黏性末端,中心轴线两侧切开,限制酶切割的是什么？,两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键.,1、下列关于限制酶的说法正确的是（）A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键,B,2.右图为DNA分子结构示意图，对该图的正确描述是A的名称是胞嘧啶脱氧核苷酸B解旋酶作用的部位是C某限制性核酸内切酶可选择处作为切点DDNA连接酶可连接处断裂的化学键,BD,磷酸二酯键,磷酸二酯键,双链,单链,在两DNA片段之间形成磷酸二酯键,将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键,都能形成磷酸二酯键,基因工程的基本操作程序,（1）目的基因的获取（2）基因表达载体的构建（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成,（一）从基因文库中获取目的基因,1.什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，每个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,基因组文库的构建,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库（cDNA文库）,cDNA文库的构建,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子,启动子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,（二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR多聚酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,PCR技术,原理：前提：原料：方式,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,一段已知目的基因的核苷酸序列（模板DNA）DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,逆转录法,目的基因的信使RNA,双链DNA（目的基因),化学合成法,蛋白质的氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,人工合成,逆转录酶,3、人工合成目的基因,推测,推测,单链DNA,DNA聚合酶,总结、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。,编码蛋白质,核苷酸,染色体,转录,表达,体外,核苷酸,引物,人工合成,下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B C D,D,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,二、基因表达载体的构建核心,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,二、基因表达载体的构建,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,基因工程的核心,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,e、复制原点,表达载体,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。用_切断目 的基因，使其产生_ _。,将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,过程:,注意：载体与表达载体的区别二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构,使用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使其露出相同的黏性末端，再加入DNA连接酶。,三、将目的基因导入受体细胞,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞,花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞,2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 转基因受精卵 转基因动物,3、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态 细胞,感受态细胞 吸收DNA,表达载体与感受态细胞混合,用Ca2处理，增加细菌细胞壁的通透性,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,1,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,四、目的基因的检测与鉴定,青霉素抗性基因,四环素抗性基因,1、鉴定分子水平的鉴定,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,方法,DNA分子杂交技术,DNA分子杂交技术,1、鉴定分子水平的鉴定,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,1、鉴定分子水平的鉴定,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,2、鉴定个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,（一）植物基因工程技术的应用1、提高农作物的抗逆能力（1）抗虫转基因植物,三、基因工程的应用,（2）抗病转基因植物抗病转基因植物所用的基因：常用：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因抗真菌转基因植物中有：几丁质酶基因和抗毒素合成基因（3）其它抗逆转基因植物抗盐碱、干旱的基因：调节细胞渗透压的基因抗冻蛋白基因抗除草剂基因,2、改良农作物的品质,富含赖氨酸的转基因玉米,导入与植物花青素代谢有关的基因的矮牵牛,3、利用植物生产药物,二、动物基因工程前景广阔,（一）用于提高动物生长速度,动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等,导入外源生长激素基因,（二）用于改善畜产品的品质,举例说明,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低。,（三）用转基因的动物生产药物,设问:就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？,将药物蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，将受精卵送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。,乳腺生物反应器,获取目的基因（例如血清白蛋白基因）构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎将胚胎移植入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体的乳腺细胞中，转入的基因才能特异表达）。,思考:用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的？,膀胱生物反应器,目的基因在膀胱上皮细胞中特异性表达,（四）用转基因动物作器官移植的供体,利用基因工程对猪的器官进行改造,方法：将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官,三、基因工程药品异军突起,工程菌:用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。,四、基因治疗曙光初照,把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。（把特定的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的）,体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。,体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移的治病方法。（如将治疗囊性纤维病的正常基因转入患者肺组织）,DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。,基因诊断,五、基因芯片,从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,-DNA探针阵列,蛋白质三维结构,氨基酸序列多肽链,基因DNA,预期功能,分子设计,mRNA,生物功能,转录,翻译,折叠,蛋白质工程流程图,蛋白质工程,目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。,蛋白质工程的概念,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。,即：通过修改基因来改变蛋白质分子中的氨基酸，从而制造出具有新特征的蛋白质。,蛋白质工程以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸,合成自然界不存在的蛋白质,天然存在的蛋白质,改造基因,基因重组,对现有蛋白质进行改造，对创造新的蛋白质还未成功,已被广泛应用,蛋白质工程与基因工程的异同,都要改造基因，都属于分子水平,1、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码子B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建因受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,2、目前转基因工程可以A.打破地理隔离但不能突破生殖隔离B.打破生殖隔离但不能突破地理隔离C.完全突破地理隔离和生殖隔离D.部分突破地理隔离和生殖隔离,C,A,1、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子C合成-珠蛋白的DNAD合成苯丙羟化酶的DNA片段,B,3）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,2）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶可用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,4）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因与运载体结合,C,5）（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（）A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,