《RNAi作用机制》PPT课件.ppt
RNAi的作用机制,RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行：(1)siRNA的形成阶段；(2)RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)形成阶段；(3)效应阶段；(4)扩增阶段。,RNAi机制,外源,病毒,转座子,目标识别,内切酶切割目标,外切酶降解RNA,RdRP合成RNA,激活的siRNA复合物,双链siRNA,异常ssRNA,RdRP合成RNA,二级siRNA,目前，RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南芥等生物体内阐明的。生物体由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列(inverted repeats)转录及外源基因导入等原因，细胞中可出现dsRNA分子。当各种原因产生的dsRNA在细胞中出现时，细胞中一组特定蛋白复合物可识别dsRNA，此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合，然后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为2125nt大小的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。,(1)siRNA的形成阶段,核酸内切酶,核酸外切酶,解旋酶,Dicer,同源搜索活性,siRNAs,long dsRNA,Dicer contains two RNAse III domains,Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为2125nt大小在3端带有23个碱基悬端和5端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。,siRNAs have a defined structure,siRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对mRNA的抑制作用。在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNase核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此，Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么Dicer酶的降解产物是21nt23nt的siRNA呢?最近对RNase催化结构域的结构的研究使其真相大白。,Dicer 一种核酸酶,负责将dsRNA 转化为siRNA：它属于RNase 家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer 在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA 上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp 的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA 长度存在微小差别。,Dicer,Models for Dicer cleavage,启始阶段,加工酶,加工成21-23核苷酸片段,DicerRISC,mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解,siRNA的形成,siRNA,Dicer,RISC,(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段,生成的siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC（RNA-induced silencing complex），具有序列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。,RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC),(3)效应阶段,siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5起始端下游710个核苷酸处切断mRNA，起到特异地抑制基因表达的效果。,效应阶段,mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解,解旋酶,核酸外切酶,同源性检索活性,核酸内切酶,RISC,在这些机制中，RISC是一个很灵活的平台，在不同的情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能。RISC复合物的核心负责接受从Dicer加工来的小RNA，并用该小RNA作为识别其同源底物的向导从而介导RNAi的发生。,7/30/2023,RISC（RNA-induced Silencing Complex）,解旋酶,核酸内切酶,Argonaute protein,siRNA,mRNA,250KD(inactive),100KD(active),ATP,(4)扩增阶段,该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个重要的“感应器”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。,RNAi扩大效应,目前，对这些现象的解释至少有四种机制：,Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级siRNA”，再由后者降解同源的mRNA，故dsRNA的长度决定了放大效应的水平；siRNA在酶作用中，可多次利用，能进一步提供放大的信号；移行RNAi(transitive RNAi)中，siRNA可作为靶mRNA的引物，在RdRP和Dicer等的作用下产生“次级siRNA”，导致沉默信号的扩增。“异常RNA”(aberrant RNA)无需引物，可在RdRP的作用下生成dsRNA，并由Dicer酶切生成siRNA。以上四种机制中，尤其是移行RNAi的发现为阐明沉默效应的扩增及传递提供了重要线索。,移行RNAi,移行RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动。即沉默信号沿特定的mRNA由3 5方向移动，这就是“移行RNAi”。在移行RNAi中新生成的siRNA并非直接来自导入的dsRNA，而是在细胞中RdRP的作用下，以初级siRNA的反义链为引物，以靶mRNA为模板，生成dsRNA，随后在Dicer酶及ATP的作用下产生新的siRNA，称为次级siRNA。除RdRP通过产生次级siRNA参与RNAi信号扩增外，其他与RdRP具有同源序列的蛋白类似物也通过相同的方式产生次级siRNA参与沉默信号的扩增。,此外，RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制：(1)Dicer将长dsRNA切成初级siRNA，这一放大水平取决于dsRNA的长度；(2)siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。,
