DNA测序化学降解法.ppt

DNA序列测定,脱氧核糖,含氮碱基,磷酸,A,G,C,T,DNA的基本单位脱氧核苷酸,腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶,DNA测序：测定未知序列 确定重组DNA的方向与结构 对突变进行定位和鉴定 比较研究,成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。,第二代测序技术,三种第二代测序技术对比,第三代测序技术,第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。,Maxam-Gilbert DNA 化学降解法,基本原理：,直接或间接特异性识别4 种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5或3)打断磷酸二酯键,将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。,操作步骤,将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 电泳,读取DNA的核苷酸顺序,先用限制性内切酶把DNA切成10200bp 的测序材料；用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5末端上的磷酸；在5OH端标记 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；标记片段变性为单链；用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用哌啶甲酸切断反应碱基的多核苷酸链，紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段；经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出,该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；修饰的碱基从核糖环上转移；失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。,肼，又称联氨 NH2.NH2 在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.5M NaCl），肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂。在高温强碱作用(90,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位点发生剧烈的断裂反应,但对胞嘧啶C的反应较弱,哌啶甲酸(90,1mol/L)在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂,胞嘧啶,胸腺嘧啶,硫酸二甲酯dimethyl sulphate，DMS，（CH3O）2SO2：一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N甲基化，但是鸟嘌呤G的N甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。,热哌啶：使DNA链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致DNA链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。,DNA化学降解反应体系反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 GG+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和AC+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C和TC 肼（加盐）胞嘧啶开环 六氢吡啶 C,DMS（硫酸二甲酯）在中性pH环境，主要作用于G，被六氢吡啶作用而造成该位点上DNA链的断裂。甲酸具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点(G和A)发生断裂。肼，在碱性条件下，作用于T胸腺嘧啶和C胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于C胞嘧啶。,A C 肼 90C,NaOH(1.2M)断裂反应,在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：G+A反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。G反应-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。T+C反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应-在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。,在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：G+A反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。G反应-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。T+C反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应-在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。,哌啶,5 GATCACTACTG 3,标记,5*GATCACTACTG 3,G：DMS,C：肼（加盐）,G+A：甲酸,C+T：肼,5-*GATCACTACTG,5-*G,G,5-*GATCACTACTG,5-*GATCACTA,5-*GATCA,5-*GA,5-*G,5-*GATCACTAC,5-*GATCACT,5-*GATCAC,5-*GATC,5-*GAT,5-*GATCACTACT,5-*GATCACTACTG-,5-*GATCACTAC,5-*GATCAC,5-*GATC,-*GATCACTACTG-,在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。,、,在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。,电泳和读谱,具体的测定过程中，首先将3端或5端的双链DNA溶解在总体积为50L的、分别含有0.03mol/LNaOH、10%甘油、1mmol/L EDTA、0.05%二甲苯蓝和0.05%溴甲酚蓝的溶液中，使双链DNA变性。然后加到由5%10%的丙烯酰胺、0.16%0.33%的双丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、pH8.3的1mmol/L EDTA组成的凝胶板上，进行电泳和放射性自显影等处理，制得一端带标记的单链DNA。,电泳检测-310,步骤：毛细管灌胶,步骤：样品盘移动,步骤：电进样及电泳,步骤：荧光激发及检测,化学法读序的方法,化学法测序放射自显影图谱的识读，比较复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为4或5条垂直的阶梯带，AC反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和C+T两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段。如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。在做了AC反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基。化学法必须4或5个反应管统一阅读，DNA中4个碱基每个位置都有1个相应的片段，待测的DNA全部序列可直接读出。化学法测序采用32P标记DNA进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内。,聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开,根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。,如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。,在做了AC反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基。,DNA序列测定的应用,1)测序 PCR克隆测序验证 突变体检测 新基因测序 全基因组测序 系统发育及物种鉴定2)片段分离 个体识别：亲缘鉴定 SNP关联分析 疾病诊断等,Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度约250bp,优点：不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的 DNA 片段可以直接测序；化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G，C 含量较高的 DNA 片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。化学降解测序法既可以标记 5-末端，也可以标记 3-末端。如果从两端分别测定同一条 DNA 链的核苷酸序列，相互参照测定结果，可以得到准确的 DNA 链序列。,没有改进,操作繁琐,化学试剂的毒性大,放射性同位素标记效率偏低以致需要较长的放射自显影曝光时间,人工读取数据费时费力.目前,仅在分析特殊DNA链的核苷酸序列和分析DNA和蛋白质相互作用中的DNA一级结构时才使用,缺点：,谢谢大家!,