2016级基因表达载体的构建.ppt
,课前复习1.基因工程基本操作的四个步骤 2.目的基因是指？3.获取目的基因方法：3个4.构建基因组文库需要的酶有?5.PCR技术的名称、原理、过程,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,操作过程,目的基因的检测与鉴定,学习目标1知道、识图基因表达载体构成2.概述基因表达载体的构建过程,学法指导独立思考积极讨论规范展示精彩点评鼓励质疑,课前预习核对答案,一、1.构建基因表达载体2.稳定存在 下一代，使目的基因表达发挥作用3.标记基因 启动子 目的基因 终止子 复制原点首端 RNA聚合酶 蛋白质DNA短片段 尾端 转录 脱氧核苷酸 含目的基因的受体细胞 抗生素抗性基因4.启动子 终止子 标记基因二、（一）维持稳定 表达（二）1.双子叶植物 单子叶植物 T-DNA 染色体的DNA Ti质粒的T-DNA上 整合 染色体DNA(2)金属颗粒（3）抗虫棉2.显微注射 受精卵 雌 输卵管 子宫 3.快 单 少 钙离子 感受态 感受态,过程,基因表达载体的构建,1.是基因工程的核心步骤2.目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发辉作用。3.基因表达载体的组成 启动子 插入的目的基因 终止子 标记基因 复制远点,标记基因,各部分的功能是什么？,思考：在基因表达载体中,启动子和终止子的位置是否可以互换?试分析原因。不可以。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,使转录开始;终止子位于基因的尾端,使转录终止;只有顺序正确,目的基因才能正常转录。,合作探究1,1.启动子位于基因首端，终止子位于基因尾端，分别决定转录的开始和结束。它们由脱氧核苷酸组成。起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别决定翻译的开始和结束。它们由核糖核苷酸组成。,基因表达载体的构建核心,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,4.过程:,GAATTC,GAATTC,目的基因1,CTTAAG,载体1,酶1,酶1,酶1,1.自身环化（包括目的基因环化，质粒再环化）2.两个DNA片段连接时有：载体-载体连接物；目的基因-载体连接物；目的基因-目的基因连接物 3.反向连接,一种限制酶切割构建基因表达载体时可能出现：,如何防止自身环化与反向连接？,可选用两种不同的酶同时切割,GAATTC,AAAGCTTT,目的基因3,TTTCGAAA,黏性末端-TCGA-,CTTAAG,黏性末端-TTAA-,酶3,酶1,酶1,酶3,基因表达载体的构建核心,同种限制,同（一或两）种限制,DNA连接,基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,基因表达载体的构建,1.是基因工程的核心步骤2.目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发辉作用。3.基因表达载体的组成 启动子 插入的目的基因 终止子 标记基因 复制远点,检测,1.C 2.C 3.（1）Ti质粒 T-DNA 携带外源基因的DNA 表达载体（含有目的基因的重组Ti质粒）含有重组质粒的土壤农杆菌（2）构建表达载体 植物组织培养（3）75 50 减轻农药对环境的污染，防止农药危害人体健康。,练习案3答案,1.C 2.A1.（1）目的基因载体连接物 载体-载体连接物 目的基因-目的基因连接物 分离纯化（2）载体-载体连接物 目的基因-载体连接物、载体-载体连接物（3）启动子 mRNA（4）EcoRI和BamHI2.（1）.NgoMIV（2）.ABD（3）.ABC（4）.B,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,3、目前转基因工程可以A.打破地理隔离但不能突破生殖隔离B.打破生殖隔离但不能突破地理隔离C.完全突破地理隔离和生殖隔离D.部分突破地理隔离和生殖隔离,C,细胞核,只有DNA的一条链,四种核糖核苷酸,RNA聚合酶,ATP,A-U C-G T-A G-C,细胞核,DNA的两条链,四种脱氧核苷酸,解旋酶、DNA聚合酶,ATP,A-T C-G T-A G-C,两个双链DNA分子,一条单链mRNA,边解旋边复制，半保留复制,边解旋边转录,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达,1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,2.转化,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,基因组文库的建立方法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与运载体连接,导入受体菌中储存（基因组文库）,目的基因,分离,部分基因文库的建立方法,mRNA,反转录酶,单链DNA,合成,双链DNA（cDNA）,载体,插入,导入,受体菌群（cDNA文库）,分离,目的基因,cDNA合成过程,第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的 DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降 解，使之变成单链的DNA。第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合 成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,2023/7/29,25,1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A.B.C.D.,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4.有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,5.哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,7、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA,8、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,9、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温A BC D,D,10、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个,B,11、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法 B、基因组文库法C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,12、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B C D,A,D,13、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。,编码蛋白质,核苷酸,染色体,转录,表达,体外,核苷酸,引物,人工合成,14、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,15、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,16、目前转基因工程可以A.打破地理隔离但不能突破生殖隔离B.打破生殖隔离但不能突破地理隔离C.完全突破地理隔离和生殖隔离D.部分突破地理隔离和生殖隔离,C,17、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少18、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞A B C D,B,D,19、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,20.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A B C D,C,21.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是农杆菌转化法 基因枪法 花粉管道法 显微注射法 胚胎移植 DNA分子杂交法A BC D,C,23、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,22有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,24、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因与运载体结合,C,25、（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（）A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,26、下列哪项不属于基因工程技术的步骤（）A基因转移 B基因扩增C基因检测 D基因表达,B,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？,尝试设计,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,思考与探究：,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,
