《胚胎工程技术》PPT课件.ppt

胚胎和配子生物工程(1)(Embryonic and gametal bioengineering),陈从英,9.1 概述,一、胚胎移植的含义 胚胎移植技术 ET（embryo transfer）胚胎移植：将一头良种母畜（供体）配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种（受体）的生理状态相同的母畜体内，使胚胎继续发育成为新个体，俗称借腹怀胎。,.,提供胚胎的个体为“供体”，接受胚胎的个体为“受体”，不管供体还是受体动物都应为雌性个体。,2、胚胎移植的意义,、大大提高优良母畜的使用效率；、缩短世代间隔，大大提高品种改良的速度；、通过冷冻胚胎进口，可实现更有利的种畜遗传物质的跨国界交换；、有利于防疫工作；、可以克服不孕；、利用胚胎冷冻保存品种资源。、是发展家畜生物技术重要的研究手段。,胚胎移植的实质,胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换，而胚胎本身的遗传物质并不发生改变，因此各种性状均能保持其原来的优良特性。,为什么胚胎移植能成功?,移动到任何一头动物子宫内都能发育吗?同种动物发情排卵后,在一段时间内供体受体具有相同的生理环境为什么能收集到胚胎?早期胚胎一定时间内处于游离状态供体和受体会不会发生排斥/同种动物之间基本上不排斥为什么移植的胚胎能保留供体双亲的特性?胚胎虽然与受体有生理和组织上的联系,但遗传特性不受受体的影响,.,生理学基础,3、家畜胚胎移植的发展历史,、1890首次实现了兔的胚胎移植；、1934年成功地进行羊的胚胎移植；、50年代初羊、猪、牛的胚胎移植取得成功；、1964年在日本完成了世界上首次非手术牛胚胎移植并得到犊牛；、国外，1976年牛的非手术胚胎移植技术推广，1977年开始商业化应用；、在国内，牛胚胎移植在1978年实验成功，80年代后期到90年代初，奶牛胚胎移植开始在国内生产中应用。,流程图,.激素 经受体产生更多后代,示意图.,对供体受体的选择和处理配种或人工授精对胚胎的收集检查培养保存移植胚胎移植后检查,(1)对供、受体的选择，用促性腺激素进行同期发情处理(2)用激素对供体母牛做超数排卵处理(对供体注射促性腺激素，促进排卵)(3)选择同种优秀的公牛进行配种或人工授精(多个卵子与多个精了结合形成多个受精卵，受精的部位在输卵管)；受精卵卵裂早期胚胎(4)胚胎收集(特制的冲卵装置从母体子宫中冲出胚胎),步骤,(5)对胚胎质量检查(此时的胚胎处于桑椹期或囊胚期)(6)胚胎移植或保存(保存条件：-196的液氮)(7)胚胎移植操作方法(手术法和非手术法)(8)对受体母牛进行是否妊娠的检查(9)体内孕育，产下胚胎移植的犊牛,四、牛胚胎移植的技术路线,、供体牛和受体牛的选择供体应具有相当高的育种价值(供体牛选择遗传性能和生产性能优良个体，而受体选择则重在健康的体质和正常的繁殖能力，供体牛一般为引进的优良个体，受体为本地牛；）供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种受体健康状况良好，已进入发情季节供受体发情时间应接近或一致。,、超数排卵和人工授精,PMSG+PGF2法：在母牛发情期第812天，肌注PMSG 2000单位，48小时后，肌注15-甲基前列腺素 4mg。发情后12小时进行第一次输精；第一次输精后8小时进行第二次输精。现在使用的超数排卵的方法一般为法；具体操作方法为：在供体牛发情后的天，经检查黄体较好的牛，采用四天减量注射的方法；羊：发情周期的第12-15天，促性腺激素处理的第二天或第三天，注射PG,为什么在天开始？为什么要使用？,牛超数排卵时间表,供体超排处理,供体母畜的配种,必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束。配种前应对种公畜的精液进行质量检查。可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。,供体配种,4.胚胎的收集,胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布林斯特液SOF合成输卵管液手术法收集胚胎输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚子宫角冲胚非手术法收集胚胎二路法三路法,3、胚胎回收（冲胚）,牛胚胎回收（冲胚）：在牛发情后（发情之日计为第0天）的第七天采用非手术法回收胚胎。一般供体牛每两个月超排一次，平均每次超排能获得可用胚胎6-7枚。在新疆的最高记录是一头牛一次超排获得48枚可用胚胎。冲胚所用的液体为PBS液，其主要成分有：Nacl、Kcl、KH2PO4、Mgcl2.6H2O、Na2HPO4、丙酮酸钠、葡萄糖、牛血清白蛋白、青霉素、链霉素无菌操作的重要性,移胚,配种后3天的供卵巢,供体羊胚胎收集,收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中。胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。,4.胚胎的检查,收集到的冲冼液，需静置10min，使胚胎下沉到容器底部，然后移去上清液，再放于解剖镜下检查胚胎的数量和发育情况，再将发育正常的胚胎收集到注射器或移植管内供移植用。胚胎的检查项目：1.受精卵整体的形态和体积大小；2.透明带形状，厚度及损伤程度；3.发育正常胚胎的卵裂球应该具有整齐的外形，大小一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚龄一致；4.卵细胞表面颗粒的状态和多少等。,4.胚胎的检查,4、胚胎质量鉴定,牛胚胎大小直径约为（第七天）一般分为A、B、C三个等级A级：胚胎形态完整，轮廓清晰，分裂球大小均匀，结构紧凑，无附着的细胞和液泡或很少；B级：轮廓清晰，色调及细胞密度好，可见到一些附着的细胞和液泡；C级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞和液泡较多。,目前，胚胎的发育阶段采用以下系统来划分,牛的异常胚胎示意图,12级牛胚胎,6天收集的胚胎（未拣）,二细胞至四细胞胚胎,胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中,5.胚胎的保存,6、胚胎冷冻,胚胎冷冻的难点：冷冻液的毒副损伤 降温过程的冷冻损伤三步平衡冷冻法 胚胎分别用含3%、6%、10%甘油且含10%牛血清的PBS液的保存液浸渍5分钟后，用含10%甘油的PBS 装管冷冻。一步法冷冻 胚胎用含10%血清的乙二醇溶液平衡后直接冷冻,牛胚胎冷冻程序示意图,7、受体的同期发情处理,自然发情（妊娠率更高）一次同期法（PG）（妊娠率较低）两次同期法（PG）（妊娠率更高）11天内注射两次PG发情观察极为重要,手术法移植非手术法移植,7.胚胎移植,受体移胚,7、胚胎移植,受体牛发情后的第七天经检查黄体合格后移植对黄体的要求？移植步骤主要有：直肠检查、解冻胚胎检查、胚胎装管、麻醉、移植,胚胎装管,牛胚胎的移植采用非手术法，用移植枪将胚胎移入子宫角的前端。,7、胚胎移植,供体和受体的抗炎处理健康状况检查返情状况检查妊娠检查及妊娠确定,8.胚胎移植后观察及处理,9、妊娠诊断,1、乳汁孕酮测定法2、B超诊断法3、直肠检查法 孕角及子宫体明显增大，孕角较空角粗约一倍；角间沟已不清楚；子宫角的一部分进入腹腔；孕角壁软、薄，内有液体波动；子宫体触诊一般不收缩。,胚胎移植产出的犊牛,一次移入三枚胚全部成活,受体母羊与所生羔羊,The end！,