《细胞骨架蛋白》PPT课件.ppt

,第八章 细胞骨架蛋白 第一节 概论 第二节中间丝蛋白质 第三节 肌动蛋白微丝系统 第四节 微管系统蛋白质,细胞骨架蛋白：细胞质中由蛋白丝组成的非膜相 结构系统的蛋白质称为细胞骨架蛋白.细胞骨架系统：微丝、微管和中间丝组成。三个系统分别由许多性质不同的蛋白质所构成，但它们的三维结构、装配和解聚、以及功能却有明显的共同之处。,微管、微丝和中间丝蛋白免疫荧光图片大鼠肾细胞系（PtK-1）；绿色荧光（蛋白质）：红色荧光（细胞核DNA）,广义的细胞骨架还包括 核骨架（nucleoskeleton）、核纤层（nuclear lamina）细胞外基质（extracellular matrix）三者形成贯穿于细胞核、细胞质、细胞外的一体化网络结构。,构成细胞骨架的主要蛋白质：肌动蛋白（肌动蛋白相关蛋白）微管蛋白（微管相关蛋白）中丝间蛋白（各种中间丝相关蛋白）本章主要介绍它们的分子特征，功能，纤丝的形成与解聚的调控。,细胞骨架的功能：维持细胞一定的形状；参与动物细胞的运动（如巨噬细胞、白细胞通过 阿米巴样的作用在组织中迁移与骨架的聚合 和解聚相关。细胞分裂、收缩、细胞的纤毛 活动都与细胞骨架有关。)细胞内部成分的转运（如神经轴突的生长，达 500cm或更长。细胞分裂时，染色质向细胞的 转移）,细胞骨架的主要功能,（来自 G.Karp 2002）,第一节 概论 一、细胞骨架的概念 二、纤丝系统的功能 三、相关蛋白的功能,一、细胞骨架的概念 当细胞膜被非离子型表面活性剂破坏时，大部分胞质流失，这一部分称胞液（cytosol）。细胞骨架（cytoskeleton）：细胞流失胞液后的不溶残余部分,仍保持细胞外形,具有决定细胞形态作用的纤维网络。细胞骨架相关蛋白：在肌动蛋白微丝、中间丝、微管纤丝纯化时被共同纯化的蛋白质，称为相关蛋白（associated proteins）。,二、纤丝系统的功能 纤丝的功能有很多共同之处，如：形成网络决定细胞的形状；加固细胞成分；纤维收缩（反平行纤丝滑行）如肌肉收缩；杆体收缩（平行纤丝滑行）,如纤毛和鞭毛活动；导向转运的轨道，如神经细胞中沿微管转运物质或颗粒；沿纤丝传导信息。,三、相关蛋白的功能相关蛋白通过以下方式控制纤丝聚合：与单体结合,防止单体聚合；启动聚合过程；当聚合达到一定长度后封闭纤丝的尾端（加帽）；通过等量蛋白结合促进纤丝延长；促进解聚，包括切短；通过酶学作用修饰聚合体的亚单位；结合在纤丝的周边而加固纤丝；将纤丝交联成束或网络；有时形成纤丝突起，与其他类型纤丝、膜系统相互作用，通过结构间的张力，形成交联桥，产生运动。,第二节中 间 丝 一、中间丝的结构 二、组成中间丝的蛋白质及其分类 三、中间丝相关蛋白 四、中间丝的功能,一、中间丝的结构 各种中间丝（IF）结构非常相似，直径10nm,处于微管和微丝之间，故名中间丝（或10nm纤丝）。,几种中间纤维的模式图,中间丝,巢蛋白(Nestin,一种中间丝蛋白，绿)神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP,红）,IF的蛋白质分子量和等电点不同，分成几类：细胞角蛋白（cytokeratin）结蛋白（desmin）波形蛋白（vimentin）神经丝蛋白（neurofilament protein）胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）核纤层蛋白（lamin）等。有些细胞IF很多，如上皮细胞(皮肤抗磨擦和脱水)，有的细胞完全没有。,IF蛋白的分子特征 分子中有一个中间结构域，其中93%氨基酸可形成螺旋，也称杆状结构域（rod domain），N端有Mr15kD头部，C端为Mr5-10kD尾部。杆状结构域具有7氨基酸重复序列，它们形成卷曲螺旋（coiled coil），杆状结构域长度比较恒定（约310个氨基酸残基）。两端为非螺旋区，尾部耐受胰凝乳蛋白酶的水解，头部有许多折叠结构，可被胰凝乳蛋白酶水解。,中间丝的结构 中间丝结构装配和排列尚有争议。,二、中间丝的蛋白质及其分类 据氨基酸序列、基因结构、组装特性及组织特异性表达模式型（酸性）角蛋白；型（中性和碱性）角蛋白；型，如波形蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白及外周蛋白；型，包括神经丝蛋白和-介连蛋白；型，包括核纤层蛋白A及其剪切体核纤层蛋白C，核纤层蛋白B1和B2；型，包括巢蛋白、微管卷曲蛋白和desmuslin。植物、真核微生物、非脊椎动物细胞也有IF，结构基本相似，了解还不多。,（一）角蛋白（IF多肽型和型的异多聚体）角蛋白家族是IF蛋白中存在最多的一类。据硫含量的多少（即二硫键）将角蛋白分为硬角蛋白和软角蛋白，占上皮细胞胞质蛋白的80%。角蛋白种类很多，皮肤细胞至少30种。角蛋白分子通常形成异多聚体，即由一个型（酸性的）二聚体和一个型（中性/碱性）二聚体组成异四聚体。角蛋白有形成束的特性。最易观察到的是硬角蛋白，分布在毛发、甲、角和蹄等。这些组织的形成是由于整个细胞的固化，而不是简单的将硬角蛋白分泌到表面。,（二）同多聚体型IF 在各种非表皮细胞内形成中间丝，其氨基酸同源性很高。包括以下几种：1.波形蛋白2.结蛋白 3.胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）4.外周蛋白（peripherin）,1.波形蛋白（vimentin）间质细胞（如成纤维细胞）的主要结构蛋白，C端尾部特异地结合于细胞核外膜，N端头部结合细胞膜，故在细胞核和细胞膜之间形成联接。波形蛋白有蛋白激酶C和蛋白激酶A磷化位点，通过磷酸化与去磷酸化，可改变不溶的中间丝网络。,波形蛋白/胆碱乙酰基转移酶,2.结蛋白 结蛋白（desmin）是肌细胞的主要IF蛋白，在平滑肌中含量特别丰富。在平滑肌细胞中，结蛋白中间丝形成一个相互连接的网络，连接胞质的致密体（dense bodies，相当于横纹肌的Z-盘）和细胞膜的致密体斑块（dense plaques）。在横纹肌中，结蛋白靠近两个细胞的细胞膜连接，也存在于Z-盘。,心肌结蛋白染色,3.胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）胶质细胞专一的中间丝，具有支持神经细胞的作用。GFAP可作为免疫标记。4.外周蛋白（peripherin）存在于外周神经系统和某些中枢神经系统的神经细胞。它可与型IF多肽聚集，但在性质上更类似于结蛋白和波形蛋白。,皮肤过度松弛症(遗传缺陷)胶原纤维不能正确地装配,（三）神经丝蛋白 神经细胞的中间丝称为神经丝（neurofilaments,NFs），由神经丝蛋白组成。神经丝蛋白:异多聚体，三种亚基：NF-轻链（NF-L）、NF-中间链（NF-M）和NF-重链（NF-H）。单一的NF-L可聚合成丝状体，而NF-M和NF-H不能聚合；分子中多个磷酸化位点，带多个负电荷。C末端：富含谷氨酸；用蛋白酶处理后，残余的10nm纤丝与其他类型的中间丝差异很小。,（四）核纤层蛋白 核膜内表面的一层网络状纤维蛋白质，称核纤层（nuclear lamina）脊椎动物细胞中有三种类型的核纤层蛋白(A,B,C),A和C:是不同的剪接体；B:由另一基因编码,经翻译后修饰,在C端添加疏水的异丙基,以帮助核纤层蛋白B插入到核膜的内脂层。,核纤层蛋白的功能：1.保持核的形态：是核被膜的支架。用高盐溶液、非离子去污剂和核酸酶去除核物质，剩余的核纤层仍能维持核的轮廓。使胞质骨架和核骨架形成网络结构。2.参与染色质和核的组装：核纤层在细胞分裂时呈周期性变化.间期核中：为染色质提供核周边锚定位点。前期结束时：核纤肽磷酸化，核膜解体。分裂末期：核纤肽去磷酸化、重新组装，介导核膜重建。,四、中间丝的功能 了解甚少，主要功能：加强细胞韧性、抗张力破坏。使细胞器固定于细胞质，如角蛋白K14剔除小鼠线粒体成簇聚集。缺少IF的成纤维细胞，细胞核形态失常。,第三节 肌动蛋白微丝系统 主要成分是肌动蛋白，肌动蛋白是含量最多的细胞骨架蛋白；物种间氨基酸高度保守，单体聚合成微丝后结构也几乎不变。但是不同单体产生的微丝在稳定性和与其他蛋白质（如肌球蛋白）相互作用方面有细微的差别。,一、肌动蛋白单体肌动蛋白是微丝的结构蛋白,由单体和多聚体两种形式存在，单体也称球状肌动蛋白(G-actin),Mr:43kD，由两个结构域组成，结构域之间为短的柔性连接肽（ATP结合部位）。单体可与其他分子作用,包括:肌球蛋白（myosin，）、原肌球蛋白(tropomyosin)、肌动蛋白抑制蛋白（profilin）和肌动蛋白蚕食蛋白（depactin）等。,二、肌动蛋白微丝的聚合肌动蛋白多聚体形成肌动蛋白丝,也称纤维状肌动蛋白(F-actin)。肌动蛋白纤维由两条线性排列的肌动蛋白链形成螺旋，状如双线捻成的绳子。,肌动蛋白微丝的聚合过程,肌动蛋白纤维装配过程:成核、生长、动态平衡三个连续的过程。,肌动蛋白单体有极性,装配呈头尾相接,故微丝(MF)有正极与负极。体外实验：MF正极与负极都能生长，正极生长快，负极慢；去装配时，负极比正极快。由于G-actin在正极端装配，负极去装配。在体内,有些微丝是永久性的结构,有些微丝是暂时性的结构。,原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)图,在生长、发育的信号调控中具有重要的调控作用.,三、肌动蛋白相关蛋白 肌动蛋白+肌动蛋白相关蛋白（actin-associated proteins,AAP）性质发生改变.已分离到许多AAP，多数细胞含有10多种APP，AAP与肌动蛋白的互作是竞争性的。,（一）钙结合蛋白 许多肌动蛋白相关蛋白（AAP）与肌动蛋白结合受Ca2+控制,分子中有专一的Ca2+结合部位。如小白蛋白（parvalvumin）,是一种钙结合蛋白,分子中具有EF手结构,在钙浓度为10-6mol/L时能与钙结合(胞内外Ca2+浓度相差1万倍左右),许多钙结合蛋白都有类似结构。,（二）控制聚合的蛋白质 这类蛋白质能够通过加帽（capping）、单体结合（monomer-sequestering）和解聚(depolymerization)来控制肌动蛋白的聚合，有以下几类：,1.加帽蛋白（capping protein）可选择性阻断F-肌动蛋白微丝的一端.如倒刺端加帽蛋白会造成微丝缩短，而尖端加帽蛋白会造成微丝的延长。这种作用使细胞骨架重排，对那些高运动性细胞特别重要。尖端加帽蛋白:辅肌动蛋白（-actinin）,Mr类似肌动蛋白。倒刺端加帽蛋白:简称HAI，Mr约20kD，可能是Mr为150kD-200kD 蛋白质的水解产物。,肌动蛋白丝两端生长 用加帽蛋白封住负端,微丝继续快速加长,假如用加帽蛋白封住正端,F-肌动蛋白加长的速率非常慢，表明正端是生长端。,2.F-肌动蛋白切割蛋白 钙结合蛋白，但无EF手结构，故不属钙调蛋白类。常见有胶溶蛋白（gelsolin），该蛋白既具有倒刺端加帽蛋白活性，又具有钙激活的微丝切割活性。存在于细胞中，也可分泌入血（有一段分泌前导肽）。血中胶溶蛋白具有清除死亡细胞释放入血的F-肌动蛋白功能。,肠绒毛蛋白（villin）：具Ca2+依赖性切割活性；片段化蛋白（fragmin）：参与肌动蛋白的切割调节；肌割蛋白（severin）：具加帽和切割活性；胶溶蛋白及相关切割蛋白也有肌动蛋白聚合的成核作用。当将其加入G-肌动蛋白溶液时，G-肌动蛋白的聚合反应加强。,3肌动蛋白单体结合蛋白 能与G-肌动蛋白单体形成1:1复合物，阻止肌动蛋白聚合。如肌动蛋白抑制蛋白（profilin）是一种小分子碱性多肽（Mr12kD-15kD），首先从胸腺获得，血小板中含量最高；酵母中也发现一些大小和性质相似的蛋白质。体外实验发现，它能降低G-肌动蛋白单体聚合反应。敲除其基因的酵母不能成活(致死性)。,4F-肌动蛋白解聚蛋白 小分子肌动蛋白，具有胶溶蛋白和肌动蛋白抑制蛋白的双重活性，能切割F-肌动蛋白并结合G-肌动蛋白单体，这些蛋白被称为肌动蛋白解聚因子。如人类大脑分离的cofilin（磷蛋白，去磷酸化后易位到细胞核，Cofilin在细胞的运动中具有广泛而重要的作用），肾脏分离的destrin，从星鱼卵细胞分离的肌动蛋白蚕食蛋白（depactin）和从星鱼分离的载肌动蛋白（actophorin）均属于这一类。,（三）产生力的蛋白质（分子马达）主要为肌球蛋白类，可组成粗丝，具ATP酶活。肌球蛋白超家族分18类，分为传统肌球蛋白和非传统肌球蛋白，只有肌球蛋白为传统肌球蛋白，其余为非传统肌球蛋白。这类蛋白在肌肉中含量非常丰富，易聚合和解聚，故很容易纯化。常见：肌球蛋白:（不加入粗丝），使膜性小囊泡沿着肌动蛋白束运动；从阿米巴中曾分离到两种不同的肌球蛋白，即肌球蛋白IA和肌球蛋白IB。肌球蛋白:(聚合并加入粗丝）,与肌肉收缩相关。,（四）交联和促进成束的蛋白 1、血影蛋白及相关蛋白 血影蛋白（spectrin）首先从红细胞获得，故得名。从脑获得的称胞影蛋白（fodrin）。红细胞膜骨架的主要成份，分子含a链和链，Mr.均约为230kD。两个亚基反向平行排列,扭曲成麻花状，形成异二聚体,两个异二聚体头-头连接成200nm长的四聚体。再进一步形成“连接复合物”。,连接复合物的形成,2.辅肌动蛋白 辅肌动蛋白（-actinin）是保持肌节（sarcomeres）的重要元件。该蛋白是肌动蛋白成束的主要交联蛋白之一，使肌动蛋白束次序排列。在非肌细胞中则与F-肌动蛋白的作用大致相同（有血影蛋白样结构域）。辅肌动蛋白通过与整连蛋白、钙粘蛋白等作用,稳定细胞粘附、调节细胞形状及细胞运动等.,3、凝胶因子 有肌动蛋白结合位点，将肌动蛋白丝交织成网，使之形成疏松而高度黏稠的胶体。如肌动蛋白结合蛋白（ABP）和细丝蛋白（filamin）。都是双极同二聚体，长杆状分子，有相当的弯曲性，与肌动蛋白结合时对钙不敏感。,4、肌肉收缩相关的蛋白质,（1）肌动蛋白 肌动蛋白纤维由两条肌动蛋白链形成的螺旋，如双线捻成的绳子。肌动蛋白单体为球形分子，称球形肌动蛋白(G-actin)，其多聚体称纤维形肌动蛋白F-actin。,（2）肌球蛋白（myosin）如前述，属于马达蛋白，利用ATP产能，最初发现于肌肉组织(myosin II)，后发现多种非肌细胞myosin。目前已发现18种类型。Myosin II是构成肌纤维的主要成分之一。由两条重链和两条轻链组成，并两个分子尾部相连，缔合形成粗丝双极性结构，球形的头部具有ATP酶活性,肌球蛋白缔合形成粗丝双极性结构,由2条轻链和2条重链组成的肌球蛋白分子,肌小节模式图,(肌联蛋白,titin）,肌小节中粗丝在细丝间滑动模式,（3）原肌球蛋白（tropomyosin）原肌球蛋白（tropomyosin.Tm）分子量64KD，由两条平行的多肽链扭成螺旋，每个Tm分子长41nm，具有7个肌动蛋白结合位点，呈长杆状，结合于肌动蛋白双螺旋的沟中。作用:是加强和稳定肌动蛋白丝，抑制肌动蛋白与肌球蛋白结合。细丝:F肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白组成。,（4）肌钙蛋白（troponin）肌钙蛋白（troponin,Tn），Mr.80KD，三个亚基：肌钙蛋白C（TnC）特异地与钙结合;肌钙蛋白T（TnT）与原肌球蛋白有高度亲和力，肌钙蛋白I（TnI）抑制肌球蛋白的ATP酶活性，细丝中每隔40nm就有一个肌钙蛋白复合体。当肌质内钙离子浓度升高时，Ca2与TnC结合，构象改变，TnT牵动原肌球蛋白，使其与F-肌动蛋白脱离接触，从而暴露肌动蛋白单体上的肌球蛋白结合位点。促使肌球蛋白与肌动蛋白相互作用形成横桥，引起肌肉引缩。,肌肉收缩(摆动联桥模型，swinging cross-bridge model),肌细胞膜兴奋传导到终池终池Ca2+释放肌浆Ca2+浓度增高Ca2+与肌钙蛋白结合原肌球蛋白变构肌球蛋白横桥头与肌动蛋白结合横桥头ATP酶激活分解ATP横桥扭动细丝向粗肌丝滑行肌小节缩短。,5钙调结合蛋白（caldesmon）是与肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和钙调蛋白互作的平滑肌和非肌调节蛋白。平滑肌钙调结合蛋白C-末端具有钙调蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白结合区，N-末端具有肌球蛋白结合区。通过二硫键形成寡聚体，分子的两端可与F-肌动蛋白结合使其成束,与肌动蛋白的作用可被原肌球蛋白所增强。1个钙调结合蛋白可结合14个肌动蛋白单体。,（五）连接细胞膜与F-肌动蛋白的蛋白质 如粘着斑蛋白（vinculin）、踝蛋白（talin）、锚蛋白（ankyrin）、膜联蛋白（annexins）、膜桥蛋白（ponticulin）等。可与F-肌动蛋白结合并将其连接到细胞膜。,四、肌动蛋白微丝的功能 细胞结构与细胞运动。细胞分裂，特别是后期，需肌动蛋白锚定于细胞膜。近来发现，细胞骨架与细胞凋亡有关。Lanerolle和同事发现,HL-60细胞株凋亡时，F-肌动蛋白先短暂聚合，但后期即发生解聚，肌动蛋白微丝形态上发生剧烈的变化。,细胞器的转运,第四节 微管系统 几乎所有真核细胞都含微管,大多数微管是单一圆筒状,少数微管呈双圆筒状（如鞭毛）,囊状体（busal bodies）和中心粒中的微管是三圆筒状。目前认为微管中（但不是全部）含有高度保守的微管蛋白。微管蛋白Mr在55kD左右,微管蛋白（小）,微管蛋白（大）,形成二聚体。,向细胞中央辐射的微管,一、微管的结构 多数天然微管由13条原丝组成，少数微管有7、9、12或15条原丝。纯化的微管蛋白在体外重新聚合，得到的微管大多数含13条原丝，但也会出现一定比例的14和15条原丝微管，表明在蛋白纯化时丢失了一些细胞成分，使原丝数目发生了变化。,微管纤维 微管是由13条原丝（protofilament）构成的中空管状结构。,二、微管蛋白 微管蛋白的和两种亚基均可结合GTP，但GTP是亚基的固有组分，不发生水解或交换；亚基的GTP可发生水解，结合的GDP可交换为GTP，可见亚基也是一种G蛋白。,多烯紫杉醇,三、微管相关蛋白 微管相关蛋白（microtubule associated proteins，MAPs）：至少含一个结合微管的结构域和一个向外突出的结构域。突出部位伸到微管外与其它细胞组分（如微管束、中间纤维、质膜等）结合。,MAP的主要功能：促进微管聚集成束；增加微管稳定性或强度；促进微管组装。主要有两类微管相关蛋白：MAP:热敏感，如MAP1a、MAP1b，主要存在于神经细胞。MAP:热稳定，包括MAP2a、b、c，MAP4和tau蛋白。MAP2有多个磷酸化位点，磷酸化后与微管的亲和力下降，含量减少会影响树突的生长。,四、微管的组装 微管组织中心（microtubule organizing center MTOCs）是微管进行组装的区域。着丝粒、成膜体、中心体、基体均具有微管组织中心的功能。微管组织中心的微管球蛋白，可聚合成环状复合体，像F-肌动蛋白的聚合一样参与微管蛋白的核化，帮助和球蛋白聚合为微管纤维。Gary J.Brouhard（Cell）2008，发现，一种催化微管生长的聚合酶（XMAP215）促进微管蛋白聚合物结合到微管正极生长端。,中心体（centrosome）由两个相互垂直的中心粒（centriole）构成，周围是一些无定形或纤维形、高电子密度的物质，叫做外中心粒物质（pericentriolar material，PCM）。中心粒由9组3联微管构成，不直接参与微管蛋白的核化，具有召集PCM的作用。,五、微管的功能 1、支架作用 微管就像混凝土中的钢筋，起支撑作用。在培养的细胞中，微管呈放射状排列在核外,（+）端指向质膜，平贴在平皿上。,以细胞核为中心向外放射状排列的微管纤维（红色）http:/,2、细胞内运输 微管起细胞内物质运输的路轨作用，破坏微管会抑制细胞内的物质运输。与微管结合起运输作用的马达蛋白有两大类：驱动蛋白（kinesin），动力蛋白（dynein），两者均需ATP提供能量。,驱动蛋白（Kinesin）：分子特征：四聚体：两条轻链和两条重链；重链两个球形的头具有ATP酶活性；螺旋状的杆和两个扇子状的尾。哺乳动物kinesin样蛋白超过50种。,驱动蛋白（kinesin）结合并水解ATP，分子颈部发生构象改变，使两个头部交替与微管结合，从而沿微管行走，分子的尾部与受体（kinectin）结合，从而对“货物”进行转运(如轴突axon末端)。,动力蛋白（Dynein）：分子量巨大（近1.5Md），由两条相同的重链和一些种类繁多的轻链以及结合蛋白构成。因与鞭毛和纤毛的运动有关而得名。主要作用：在细胞分裂中推动染色体的分离、驱动鞭毛的运动、向着微管（-）极运输小泡。,3、形成纺锤体 纺锤体是一种微管构成的动态结构，其作用是在分裂细胞中牵引染色体到达分裂极。,4.纤毛与鞭毛的微管构成,AB,