《细胞生物学技术》PPT课件.ppt

细胞生物学最常 用的技术,细胞生物学最常 用的技术,2011年7月15-18日北京九华山庄全国细胞生物学学术大会,组织学技术,组织制片技术 胚胎学制片技术 组织细胞化学技术 荧光组织化学及免疫化学技术 组织（细胞）培养技术 各种显微镜技术,组织学技术包括：,组织制片技术,一、组织制片方法分类：大致分类为 超活体染色制片：又称体外活体染色。活体染色制片：分离制片法：涂片法、印片法、整装片、切片法 血管注射法；整体切片法；,（一）、动物处死：直接杀死法：用金属器械猛击动物的后脑 部（第四脑室区）。颈椎断裂杀死动物。空气栓塞,组织石蜡标本的制作,麻醉致死：麻醉剂应以不影响细胞原有形态结构为宜，取材越快越好，否则组织和细胞成分构造均易发生变性。乙醚吸入麻醉法 戊巴比妥钠或乌拉坦注射麻醉法,（二）、取材：1.动物的选择：必须根据教学或科研目的和 要求来确定。2.取材方法：取材顺序：先腹腔：先肝脏、胆囊，其次肾脏、肾上腺，再取胰腺、脾、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠。后胸腔及盆腔内器官、组织，最后取神经。,例如：肝脏：大体检查，又无充血、脂肪肝变性，肝硬化、寄生虫、肿瘤。然后取肝右叶或外左叶中部，作纵切或冠状切面。,胃：分贲门、胃底、胃体和幽门，胃取材以空的为好。如有食物，应用生理盐水清洗干净，检查是否有充血、溃疡。正常胃粘膜呈灰白色，因胃腺主要分布在胃体和胃底，故取材时一般取胃底和胃体部，作纵切。组织洗干净后放在滤纸上铺开，防止卷缩，而后投入固定液中。,贲门、食道交界处,胃底部,胃体部,幽门部,胃的取材：一般作纵切面,十二指肠：一般取降部和水平部，（分球部、降部和水平部）为了防止肌层收缩时粘膜外翻、变性，取材中可将固定液注射进十二指肠中，两端用线结扎，投入固定液中4-6小时后，除去二端的结扎部位，做横断切面，再继续固定。,结肠：一般取横结肠，纵切，洗净，附贴在滤 纸上。,肾脏：由于组织容易出现蛋白质变性、混浊肿胀和脂变，有时则出现肾小管自溶，因此取材和固定是关键。a.固定后再取材:b.沿肾外缘的中部纵剖成两半，然后再做扇形切面.,固定液从动脉注入，从静脉流出,纵剖成两半，再做扇形切面,肺：因主要观察肺内各级支气管和肺泡的结构，故不能取边缘，应取肺小叶的中部，一般做横切面，能看到全貌（肺内小支细支、终末细支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡）。,可观察到肺内小支、细支、终末细支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡。,脾脏：应切断各处静脉放血，必要时可切开脾脏两端，用盐水冲洗，致脾脏呈灰白色。一般做横切面取材。,切开两端，放血，用盐水冲洗,（三）、固定（Fixation）和固定液（Fixative）1.固定的目的和意义 在于保持组织内细胞的形态、构造及其组成，使其与生活时原有形态和结构相似。,2.固定的方法：小块组织固定、局部注射固定、整体注射固定、蒸气固定,3固定液：分单纯固定液和混合固定液。组织固定剂很多：最常用的有甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、醋酸。,根据它们对蛋白质的作用又分为,能使蛋白质沉淀凝固的：,不能使蛋白质沉淀凝固的：,乙醇、丙酮、苦味酸、铬酸,甲醛、重铬酸钾、锇酸、醋酸,中性甲醛：甲醛（37%-40%）100ml 磷酸二氢钾 4g 磷酸二氢钠 6.5g 蒸馏水 900ml,最常用的固定剂,（四）、组织冲洗、脱水与透明,组织冲洗：一般必须用水冲洗,其目的,a.停止固定液继续对组织的作用；,b.去除组织内固定液，以免影响染色；,方 法,简单冲洗,系列冲洗,水槽冲洗,酒精洗涤,组织脱水：（Dehydration）标本经过固定和冲洗，组织中含有大量的水分，必须除去组织中的水分，这一过程为脱水。脱水剂：即能与水在任何条件下混合，并使组织中的水逐渐出去，由脱水剂取代组织中的水分，同时又能与透明剂混合。种类：乙醇、乙醚、正丁醇、异丁醇、二氧氯环等。,乙醇,丙酮,正丁醇,乙醇：即可作固定剂，又可作脱水剂，但乙醇与水混合时有较强的物理反应，高浓度的酒精对组织有较强的收缩和脆化作用，因此组织不能直接进入纯酒精中脱水，应由低高浓度，逐渐取代组织中的水分，以保证组织脱水彻底，避免组织过渡收缩和硬化。,脱水方法：为减少组织的收缩，浓度应由低向高过渡。,50%,70%,80%,90%,95%,100%,应根据组织的体积与厚度而定。时间随组织块的体积、厚度的增大而延长。一般：11cm体积 50、70、80%各 浸泡6-8小时；2-3mm厚 95%中 浸泡2-4小时；纯酒精浸泡1-2小时；,脱水的时间（Clearing）,组织透明 组织块经脱水后，需进行石蜡包埋，然后切片，但酒精不能与石蜡混合，需经一种乙醇与石蜡之间的媒介物进行透明，即透明剂。透明剂 可取代组织中的乙醇 使组织透明，组织透明后浸入石蜡中，石蜡可取代组织中的透明剂，浸入组织中。透明剂是石蜡的溶剂。透明剂的种类：最常用的有二甲苯、甲苯、苯、香柏油等。,二甲苯：最常用，易挥发，透明力强，能溶于醇及醚，但不能与水混合，是石蜡的溶剂。组织在二甲苯中透明的时间不宜过长，否则易于收缩、变硬、变脆。故一般在浸入二甲苯前，应先经二甲苯与酒精混合液，以减少组织的收缩。,（五）、组织浸蜡与包埋1.浸蜡：组织经脱水、透明后，即进入已溶化了的石蜡中，熔化的石蜡透过组织间隙，渗透到组织中，然后包埋成组织蜡块。石蜡分：软蜡，熔点45-54，用于浸蜡；硬蜡，熔点56-58或60-62，用于包埋。,软蜡 软蜡 硬蜡 包埋,软蜡48-50 软蜡54-56 硬蜡56-60,2.包埋：即组织经固定、脱水透明及浸蜡后，使蜡浸入组织达饱和状态，并连同熔化的蜡一块倾入一个特别的包埋框内，冷却后，便凝固成定形的蜡块。,特制的包埋框,纸盒的制作,选蜡原则,夏天用溶点高的蜡（60-62）,冬天用稍软的蜡即可（56-58）,包埋：以硬蜡为好。,石蜡包埋的操作过程：,组织浸蜡至第三号蜡中,装好金属包埋框,包埋蜡置电炉上溶化，到温度应控制在65左右。,点燃酒精灯，准备无齿尖镊子，写好标签；,将熔化的包埋蜡倾入金属包埋框，或纸盒中。倒满即可。,将组织块切面朝下，放至纸盒中央，并用镊子轻微压一下，然后将标签分别放在蜡块上。,标签,切 片,铺 片,烤 片,H-E染色 1 脱蜡：二甲苯I液5-10，II液5-10。2脱苯：100%乙醇8-10。3水化：95%乙醇5，80%乙醇5。4苏木精染5。5分化：用1%盐酸作用1。6反兰：10-15（流水）。7 伊红：30-60（30秒为好）8脱水：80%乙醇一涮，95%乙醇I液一涮，95%II液一涮。100%乙醇I液7-10，II液7-10。9 二甲苯透明：I液中7-10，II液中7-10。封片,免疫组织（细胞）化学免疫组织化学（immunohistochemistry）又称免疫细胞化学（immunocytochemistry）是利用特异性抗原抗体反应原理，在原位观察和研究组织细胞内，有关特定的抗原或抗体的存在和分布，并进行定量的技术。由于抗原抗体的结合是高度特异的，因此免疫组织化学方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。,免疫组织化学包括的内容,免疫细胞化学的优点,灵敏度高,特异性强,定位准确,应用广泛,组织材料的制备免疫组织化学不仅要求保存细胞、组织内形态结构的完整性还需要保存细胞和组织内抗原的免疫性活性，因此在组织材料的制备中有一定的特殊要求。,取材 固定 脱水 浸透 包埋 切片,免疫组化的染色原理与方法 免疫组织化学染色又称免疫染色（immunostainig）根据标记的抗体的不同，可分为几种如：1.直接法（一步法）：将标记物标记在特异性抗体上（一抗），便可直接与细胞或组织内的相应抗原特异性结合而被显示；,2间接法（二步法）：将标记物标记到抗特异性抗体的抗体（二抗）上；3桥连法（多步法）：用与一抗同种动物产生的抗标记物抗体与标记物形成免疫复合物（PAP,APAAP），再通过桥抗体与一抗相连。4ABC法：利用生物素、抗生物素间亲和特性建立的方法。,固定剂的种类：醛类固定剂：10%的中性福尔马林、4%多聚甲醛磷酸缓冲液 非醛类固定剂：丙酮 Carnoy氏液，,一、免疫酶组织化学染色法（一）、酶标抗体法 1原理：酶标抗体染色分为直接法和间接法 直接法：将酶标记在第一抗体上，直接检测细胞和组织内特异性抗原。该法简便、特异性强、需时短、但敏感性低，其缺点是每一种抗原都需要用酶标记的特异性抗体，且抗体需要量大，现已不常用。（图）,组织抗原,抗体,标记物,直接标记法,间接法：所用的第一抗体是细胞组织内抗原的特异性抗体，第二抗体是第一抗体的抗体，并且已用酶标记。（图）优点是一种酶标记抗体可以与多种一抗配合检测，敏感性高于直接法。第二抗体与第一抗体必须是不同种属动物制备的，因第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备，否则就不能检测出不同特异性抗原的存在。,第一抗体：是细胞内抗原的特异性抗体,标记酶的二抗：是一抗的抗体,抗原,间接法,2 显色反应 免疫组织化学方法最终的生成物是带有酶标记的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶性的有色沉淀产物沉积在抗原反应的位置，并借此确定该抗原的性质、存在部位的含量。反应原理如下：HRP:HRP与底物过氧化氢和DAB(3,3-diaminobenzidine,二氨基联苯胺)作用反应产物呈棕褐色。HRP+H2O2 HRPH2O2+DH2(还原型供氢体)HRP+2H2O+D(氧化型供氢体),组织抗原,抗体,标记物,直接标记法,DAB,显色原理,抗生物素-过氧化物酶复合物技术（avidin-biodin-peroxidase complex technique,ABC技术）1原理 抗生素（avidin又称卵白素或亲和素）是一种糖蛋白，分子量为68KD，与生物素有特殊的亲和力（亲和常数为1015M-1）,这种特殊的结合是不可逆的，同时又不影响彼此的生物活性。,由于抗生素分子有4个相同的亚基，是生物素的结合位点，这样它就可以同时与带有生物素分子的大多数蛋白质相结合（包括抗体和酶），使抗生素和生物素标记的酶之间形成大分子复合物，如ABC，而在这个巨大复合物中的过氧化酶活性并不受影响。,1 方法与步骤ABC法 是先将生物素与过氧化物酶偶联起来，再将抗生物素与生物素结合的过氧化酶按比例亲和组成抗生物素-生物素-过氧化酶复合物（ABC）从而保证抗生物素保留一定的游离结合位点，再与事先制备的生物素偶联的抗体结合（此抗体为二抗）由于抗生物素有4个生物素的结合位点，所以抗生物素可作为桥梁，将生物素偶联的抗体和生物素偶联的酶联在一起。,亲和素,生物素,辣根过氧化物酶,生物素标记的二抗,ABC复合物,组织上的一抗,ABC过氧化物酶法,生物素-抗生物素系统用于免疫组织化学检测的主要有两种：a.标记抗生物素生物素技术(labeled avidin-biotin technique,LAB)，即以生物素标记第一抗体，酶标抗生物素作为第二抗体，利用生物素抗生物素的亲和结合，以显示被检测的抗原；b.桥式抗生物素-生物素技术（bridged avidin-biotin technique,BRAB）,使用生物素分别标记抗体和酶，然后以抗生物素为桥，把两者连接起来，以显示被检测的抗原。,生物素,酶,抗生物素,生物素标记一抗,酶标记抗生物素,标记抗生物素生物素技术,生物素,酶,抗生物素,生物素抗体复合物,生物素酶复合物,以抗生素为桥连接两个复合物,桥式抗生物素-生物素技术（BRAB）,重症妊娠中毒症子宫蜕膜IGF-1的表达,重症妊娠中毒症绒毛膜IGF-1的表达,二、免疫金-银染色法 免疫金-银染色法（immunogold-silver staining,IGSS）是一种较新的免疫组织化学技术。原理：IGS法是在特异性抗体与抗原结合后，再用金标记的间接抗体或金标记的葡萄球菌A蛋白与特异性抗体Fc段结合。所用的标记胶体金颗粒直径在20nm以上时，可在光镜下见到红色的反应物，这就为免疫金法。,IGSS原理,通过抗原抗体反应沉淀在抗原位置的胶体金颗粒，可吸附大量的还原银原子，并在金颗粒周围形成一个“银壳”，在抗原存在的部位成黑褐色。,组织切片,Ag,Ab,GAb,GP,SP,免疫金银染色法,三、铁标记法 四、免疫荧光染色法原理：在已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，再与其相应的抗原或抗体起反应，所形成的免疫复合物上带有一定的荧光素，在荧光显微镜下即可观察到待测的抗原或抗体。五、双重或多重免疫染色法是在同一张组织切片上同时进行或先后显示两种或两种以上的抗原成分。可以在同一个标本上同时了解不同细胞或组织与相关抗原的相互关系。,胶体铁显示淋巴细胞的粘多糖,免疫荧光染色,染色对照与非特异性染色 一、染色对照免疫组织化学必须设对照组，包括阳性对照和阴性对照。,（一）阳性对照 用已知含有靶抗原的组织切片与待测切片同步进行免疫染色，前者结果为阳性，称为阳性对照。每一批试验，每一个浓度都必须作阳性对照。阳性对照的必要性：1可证实靶抗原的存在与否；2 可检测所用抗体、试剂、染色步骤是否可靠；3可排除待检测片的假阴性的结果；4阳性对照如果出现了阴性，说明可能在抗原保存、抗体效价、或染色等某一方面存在问题，需要改正后再重新做试验。,阴性对照 阴性对照亦是不可缺少的环节。包括几种：,无靶抗原对照,空白对照,替代对照,吸收试验 用过量的纯化抗原与相应的第一抗体充分反应，使抗原上的结合位点全部与抗体结合，这种对抗原吸收饱和了的抗体不再能与组织内的抗原起反应，用这种抗体再进行免疫染色，其结果为阴性。如果再出现阳性说明抗体不纯。,抑制试验 用于检测抗原、抗体的特异性。既先将未标记的第一抗体滴加在组织切片上进行充分反应，再用标记的第一抗体滴加同一组织切片上进行第二次免疫染色，结果为阴性或明显减弱。说明第一次的免疫染色，因为标记的特异性抗血清已经先与切片上的靶抗原结合，所以第二次免疫染色时，后加的标记抗体不能再与靶抗原结合，故呈阴性结果。,未标记抗体,标记抗体,抑制试验,抗原,二、非特异染色及其清除免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性反应来显示抗原或抗体的定位。因此，凡是不属于特异染色的一切染色都属于非特异性染色，它们可造成“假阳性”结果必须进行清除。,非特异性染色的原因很多：可以是靶细胞、组织的内在干扰；可以是标记物本身的干扰；抗体自身的干扰；抗体与靶细胞组织相互的干扰；因此，清除非特异性染色对于提高免疫染色效果和正确评价免疫结果十分重要。,例如：内源性过氧化物酶 体内的某些细胞组织内都含有过氧化物酶，如中性粒细胞中的髓过氧化物酶、单核细胞、嗜酸粒细胞和组织含有的过氧化物酶，都可与过氧化氢反应，使DAB还原为棕色产物，与真正的免疫酶法的棕色产物相混淆，造成假阳性结果。所以在染色前应进行封闭，去除内源性过氧化物酶的活性。,细胞凋亡的研究方法,第一章 细胞凋亡研究方法的选择 研究方法的分类：一、根据方法的定性和定量特性分类,只能定性的方法,定量或半定量的方法,二、根据是否能将凋亡和坏死区分开分类 1不能将凋亡和坏死区分开 原位末端标记法，PI单染色法流式细胞仪检测等。2能将凋亡和坏死区分开 琼脂糖凝胶电泳，形态学观察(特别是透射电镜是区别凋亡和坏死最可靠的方法)，Hoechst33342PI双染色法流式细胞仪检测，Annexin VPI双染色法流式细胞仪检测等。,三、根据样本来源不同选用不同的方法分类,组 织,培 养 细 胞,第二章 富集或分离凋亡细胞一、利用死、活细胞对胰蛋白酶和DNA酶的敏感性差异(一)原理1.活细胞对胰蛋白酶和DNA酶不敏感，活细胞具有完整细胞膜结构，对细胞具有保护作用。2.死细胞细胞膜受损，细胞极易被二酶消化。,(二)材料 1胰蛋白酶(Trypsin)浓度为05，以Hanks液配制，30存放。2脱氧核糖核苷酸酶(DNase)浓度为20ul/ml，以Hanks液(内含Ca2+，Mg2+)配制，30存放。(三)方法1离心收集细胞(1000-2000rmin，510min，实体瘤或组织必须先机械分散)，以Hanks液配制成02ml悬液(106细胞)。2加100ul DNase I(终浓度67ug/ml)，37 温育15min，再加入100ul胰蛋白酶(终浓度125mgm1)，37继续温育30min。3.加5ml含10小牛血清的Hanks液终止Trypsin及DNaseI酶反应，离心收集细胞。4以Hanks液洗涤2-3次后，细胞重悬于Hanks液备用。,本法富集细胞80-90以上排斥台盼蓝及Propidium Iodide(P1)染色的细胞为活细胞，或早期凋亡细胞，适用于凋亡细胞的进一步分析，如固定后涂片或制作成电镜切片观察形态，荧光染色进行流式细胞光度学分析等。,凋亡细胞具有完整细胞膜结构,排斥胎盘兰染色,坏死细胞被胎盘兰染色,坏死细胞细胞膜受损，易受酶的消化,二、percoll密度梯度离心法(一)原理：Percoll是一种密度梯度介质，由聚乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶颗粒组成，不粘附细胞膜，对细胞无毒性，可形成等渗、均一的密度梯度。由于凋亡细胞全面固缩、浓聚而密度增高，因此利用坏死、活细胞和凋亡细胞的密度差异经Percoll密度梯度离心分离富集凋亡细胞。,percoll密度梯度离心法,80%-90%的凋亡细胞沉积在底部,凋亡细胞的形态学检测,坏死组织周围有炎性反应,核的变化发生在晚期以核溶解和消失为主,早期细胞膜的完整性既遭到破坏,细胞坏死,比 较,周围组织中 无炎性反应,细胞膜一直保持完整性,细胞凋亡,根据细胞凋亡与坏死的形态学特征，目前已经设计出许多不同的细胞凋亡形态学研究方法。第一节 普通光学显微镜观察方法 一、倒置显微镜的观察结果分析：凋亡细胞的胞膜结构和功能仍保持完整无损，皱缩外突(blebbins)可有突起，细胞体积变小，全面皱缩(shrinkage)；凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围，其折光性与正常细胞一致。,二、苏木素伊红染色(HE染色法)1.石蜡组织切片的HE染色（略）结果判断：光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等。坏死组织则呈匀质红染的无结构物质，核染色消失。,HE-染色细胞凋亡,2细胞爬片或细胞涂片的HE染色(1)细胞爬片或细胞涂片的制备：(2)结果判断：细胞爬片上，凋亡的细胞变圆、变小，细胞核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色；可见细胞膜皱褶、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies)。,HE染色的凋亡细胞,HE-染色细胞调亡,HL-60细胞50mol/L表鬼臼毒素吡喃葡糖苷（etoposide)处理6小时后，出现大量的凋亡细胞（A),少量的活细胞(L)，一些坏死细胞（N)。,1.TdT介导的dUTP缺口末端标记技术显示凋亡,2.BrdU 标记法显示细胞凋亡,三、甲基绿派诺宁染色法,原理：细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而细胞坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。,原理：根据甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性这一特点，可使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。,光学显微镜下凋亡细胞固缩，细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染。四、Ciemsa染色 一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染色。五、瑞氏(Wright)染色,电子显微镜观察细胞凋亡 透射显微镜观察方法透射电镜是观察细胞凋亡最可靠的方法，凋亡细胞在透射电镜下其形态学改变具有特征性。在细胞凋亡的早期，细胞核染色体发生边集，在细胞核膜周边聚集形成新月体形；随之染色体发生固缩，显示电子密度增强，核形不规整等。,荧光显微镜观察凋亡细胞原理一：荧光素(fluorochrome)是一种染料，它可以吸收激发光的光能和发射荧光。一定的荧光素可以与组织或细胞的某些成分(如染色体)中的分子或功能基团进行特异性结合，可呈现一定颜色的荧光。,原理二：许多荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合，可用作细胞DNA的荧光探针。用DNA荧光探针染凋亡细胞DNA，即可在荧光显微镜下直接观察核形态变化。,5-溴脱氧尿嘧啶核苷诱导MKN45 细胞凋亡核DAPI荧光染色,BrdU 标记法显示细胞凋亡,常用的荧光染色方法 吖啶橙的荧光随pH而变，其正色为绿色，随pH下降可变到橙红色。吖啶橙与DNA和RNA通过两个部位结合，连接碱基对和磷酸盐基团，吖啶橙与碱基对结合，形成第一复合物。第二复合物在多核苷酸表面，由吖啶橙与磷酸盐基团连接而成。pH6.0时，DNA结合染料的聚合加速，pH低于3.8时，聚合受抑制，但RNA在pH6.0和3.8都能聚合，而使颜色变红。,1吖啶橙染色法（1）试剂及配制 吖啶橙贮存液：10mg吖啶橙溶解于100ml PBS中，pH4860滤过，4避光保存。（2）操作方法 制备活细胞悬液，浓度约为107ml。取95l的细胞悬液，加5l的吖啶橙贮存液混匀。吸一滴混合液点在洁净玻片上，直接用盖玻片封片。,结果判断:在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红色荧光。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片。细胞坏死时，细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失。,凋亡细胞的丫啶橙/溴化乙锭染色。活细胞呈现均匀的绿色；凋亡细胞凝集的染色质呈现黄色的斑点；凋亡细胞由于失去膜的整合性，与溴化乙锭共染时呈现橙色。,2Hoechst33258染色法Hoechst33258及33342两者均为特异性DNA染料，与AT键结合，但在pH20环境下则优先与RNA结合。因此，染色DNA时，应调整染液的pH直至7.0。,（1）试剂及配制 Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg，用20ml蒸馏水溶解后，滤过，4 避光保存。用时蒸馏水10倍稀释成染色液。PBS(无Ca2+，Mg2+)，p1H72。封片液(pH55)：20mmolL柠檬酸，50mmolL磷酸氢二钠，50甘油。细胞固定液：甲醇冰乙酸(3：1)，现配。,结果判断 在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散、微弱、均匀荧光，出现细胞凋亡时，胞核或胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光(蓝色)及明显核形态变化，如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞。,凋亡细胞Hoechst染色。正常细胞核均匀着色，凋亡细胞由于染色质凝聚及核裂解其核着色不规则。,对照,凋亡,凋亡细胞生化特征检测方法超速离心法 原 理 以氯化铯(CsCl)连续梯度超速离心，结合溴化乙啶(ethidium bromide，EB)染色，可清楚看到DNA片段的分带。超速离心不仅能分离纯化DNA、区分开环和闭环DNA，而且也可以用于凋亡细胞染色质DNA的片段化检测。,琼脂糖凝胶电泳法 一、基本原理 琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶进行染色，可以确定DNA在凝胶中的位置。,DNA提取(1)收集细胞(2)PBS洗一次(3)加细胞核裂解液500l重悬细胞，(4)加05ml平衡酚抽提，(5)加05ml氯仿：异戊醇抽提，(6)加50l的3molL乙酸钠和2ml预冷无水乙醇,可见絮状白色沉淀物。,(7)置液氮5-10min，12000rmin离心10min沉淀DNA，去上清，真空抽干或风扇下吹干残存液体。(8)加50-100l TE缓冲液，另加5l RNase，37水浴30min。(9)取20l加上样缓冲液2-5l上样，1琼脂糖凝胶电泳(电压50V，15-2h)，UV下观察。凋亡细胞的DNA因为DNA降解成规则的大片段以及180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段而呈“梯状”条带。,结果判定：正常活细胞DNA基因组条带由于分子量大，迁移距离短，所以停留在加样孔附近。坏死细胞由于其DNA的不规则降解显现一条连续的膜状条带，凋亡细胞的DNA因为DNA降解成规则的大片段以及180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段而呈“梯状”条带。,原位末端标记技术原理 原位末端标记(in situ endlabeling，ISEL)是将掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶如末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT)、DNA聚合酶I或Klenow大片段等的催化下与凋亡细胞(因内源性核酸酶的激活而产生)的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。,外源性核苷酸(双链DNA),内源性核苷酸（单链、或双链DNA),末端脱氧核苷酸转移酶（TDT),这类方法统称原位末端标记。,用辣根过氧化酶+底物DAB来显示；,生物标记,通常有两种方法：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling)，简称TUNEL；DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位缺口平移(in situ nick translatin)简称INST。,根据标记在dUTP上的标记物和显示系统的不同，可分别作组织切片凋亡细胞的原位检测、培养细胞涂片和培养细胞的流式细胞仪检测。,常用的标记物和显示系统有：生物素标记的dUTP(biotindUTP)，其相应的显示系统为卵白素(avidin)或链卵白素(streptavidin)标记的辣根过氧化物酶(HRP)和显色底物DAB；地高辛(digoxigenin)标记的dUTP(digoxigenindUTP)，显示系统为辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(正常羊IgC的Fab片段)和DAB；荧光素标记的dUTP(常用F1TCdUTP)，用流式细胞仪分析或在荧光显微镜下观察。,值得注意的是：就ISEL技术本身而言，是不能区别凋亡、坏死和自溶性死亡，必须结合凋亡细胞的形态学特征加以判断。TUNEL和ISNT鉴定标记的阳性细胞可结合下列标准加以判断：单个或少数几个孤立地分布在组织中；具有凋亡细胞的核特征，即核固缩显示一个或多个染色体团块，凋亡小体核片段；周围或局部无炎症反应的征象。,TUNEL标记组织切片，TUNEL阳性细胞核呈深棕色。,流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用 流式细胞仪检测细胞凋亡的原理一、原理：激光照射单细胞，其瞬时产生的散射光和荧光被接受转换成电信号。散射光分为前散射光(FLS)和侧散射光(90 CLS)。FLS可分析细胞直径大小，90 CLS可分析细胞表面形态、胞内颗粒大小、多少及分布状态。,当细胞染上荧光染料后激发出可测荧光，将此转换成电信号送至计算机处理就可获得有关细胞的大量信息。在目前细胞凋亡的研究中，常使用一些与核DNA结合的荧光染料。来显示细胞凋亡时细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变,二、细胞膜的改变*流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活(viable)”细胞和“死(dead)”细胞，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。*活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大的细胞毒作用。*凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显地改变，但细胞膜的通透性已有增加，因此进入凋亡细胞中的Hoechst33342比正常细胞的多。,*凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合*凋亡细胞膜上的p糖蛋白泵功能受到损伤，不能有效地将Heoehst33342排出细胞外，使之在细胞内积累。*正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对EB、PI或7AAD等染料拒染，故这些染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中。坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。,根据这些特性，用Hoechst33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。,通过流式细胞术观察细胞凋亡具有以下特征：由于细胞内核酸内切酶的激活，使DNA降解，DNA特异性荧光染色减少。细胞质膜完整。线粒体仍有膜电位。保留了ATP依赖的溶酶体质子泵。蛋白含量明显减少，主要是因为细胞的内源性蛋白酶被激活。,蛋白含量明显减少，主要是因为细胞的内源性蛋白酶被激活。凋亡发生时，前散射光减少，侧散射光不变如HL60细胞；或侧散光增加如胸腺细胞。,细胞凋亡发生时，由于细胞的DNA裂解，在流式细胞术的DNA图上呈现亚二倍体核型峰的特征。但有时坏死细胞中也会出现此特征。,因此，为更准确地区分坏死和凋亡，可同时采用两种不同的DNA染色剂，根据其穿透正常和凋亡细胞胞膜的能力及其与凋亡细胞DNA结合能力的不同来达到区分正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞。,Hoechst 33342,EB、PI染料不能进入细胞膜完整的活细胞中，,正常细胞,凋亡细胞,死细胞,Hoechst 33342和PI双染色,流式细胞术检测细胞凋亡的细胞周期特异性 应用流式细胞术不仅可以从细胞的形态和特征上鉴别出凋亡细胞，还可用来确认处于什么细胞周期的细胞易于发生凋亡，,A:G2/S期细胞凋亡；B:前G1期细胞凋亡；C:G2/S期细胞凋亡(TUNEL染色）；D:前G1期细胞凋亡(TUNEL；,流式细胞术定量测定细胞凋亡时 蛋白质的表达情况测定蛋白质表达的机理与测DNA变化的机理相似。可先使各待测蛋白质通过免疫荧光或生物素亲和反应带上特异的荧光，这样流式细胞仪就可检测到。所测的蛋白质可以是细胞标志物、受体、抗原或抗体等，它可以在细胞表面、胞浆内，也可在细胞核内。,细胞培养(cell culture),基本概念：是指从体内取出组织、细胞在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。从广义上讲组织培养与体外培养同义。,体外培养（In vitro）包括：*细胞培养(cell culture)*组织培养(Tissue culture)*器官培养(Organ culture),二、体外培养细胞的分型 可分为贴附型和悬浮型两大类：贴附型：在培养时能贴附在支持物表面上生长，大多数培养细胞呈贴附型生长，这种细胞又称：贴附型细胞或 锚着依存型细胞,体外培养贴附型细胞根据形态大致分为几类：a.成纤维细胞型：胞体呈梭型，或三角形，有2-3个突起，生长时称放射状。由中胚层间充质起源的组织。b.上皮细胞型：扁平，不规则多角型、园核，细胞彼此紧密连接成单层膜。起源于内外胚层细胞，如：皮肤表皮，肺泡上皮，消化管上皮，肝、胰等。,成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起,上皮细胞：扁平、多角形、园核,可连成单层,c 游走细胞型：在支持物上散在生长，一般不连成片，细胞常有伪足，呈活跃的游走，或变形运动。d 多形细胞型：还有一些组织和细胞如：神经组织的细胞难以确定它们的规律。,血管内皮细胞（梭性、三角形、有2-3个突起）,内皮细胞,上皮细胞、肿瘤细胞及游走细胞,癌细胞,2.悬浮型：悬浮状生长，胞体为圆形，如某些癌细胞和血液白细胞，此型细胞观察时不如贴附型方便，但允许长时间生长，能繁殖多量的细胞。,悬浮型細胞,三、培养细胞形态结构 培养细胞的形态结构与体内细胞基本相同，但大体及某些细微结构方面仍存在着一定的差异。1.大体形态：根据是否贴附生长，形态有所不同又分：悬浮生长：附着生長：,附着生长：开始为圆形形态，过渡演变为其原属形态。,随支持物的构型而改变：a 附于球体表面时，细胞与球体同心圆状。,b支持物平坦时，细胞由圆延展成圆饼形，称为放射延展细胞。c过渡为极性细胞，极性细胞形态常随着细胞运动发生变化；它们的外质的周边可分为活跃与不活跃两部分*活跃部分常伸出伪足，使细胞运动。*不活跃部分较稳定。,活跃部分,不活跃部分,极性细胞,放射延展细胞,刚贴壁细胞,四.组织培养细胞的生长和增殖过程.体内细胞生长在动态平衡环境中，组织培养细胞的生存是在瓶皿或其他容器中，生存环境和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，需分离出部分细胞和更新营养液，这一过程称“传代”。而每次传代都影响细胞的生长进程，也就是说细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。于是就出现了与体内不同的生存特点。,培养细胞生命期：是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。大多数二倍体细胞在培养中只能维持有限生存期，在整个生存过程中大致经历三个阶段。,第I期 原代培养(primary culture)期，也称初代培养期.1.从体内取组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周，此期细胞呈活跃的移动，但分裂不旺盛。,2.与体内原组织相似性大，细胞群是异质的(Heterogeneous)，即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。3.克隆形成率低（cloning Efficiency）:克隆形成率为单细胞状态培养时形成克隆的百分数，即细胞独立生存性差。4.初代培养细胞呈二倍体核型，因与体内细胞性状相似，所以是药物测试很好的对象。,第II期 传代期：初代培养细胞一经传代后便称做细胞系(cell line),又称二倍体细胞系（Diploid cell line）,此期在全生命期中持续时间最长。,初代培养,传代培养,1.此期的细胞在培养条件好的情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。呈二倍体核型的细胞系称二倍体细胞系。2.为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存，目前世界上细胞系均在不出10代后早期冻存，如果反复传代，有可能失去二倍体性质。,第III期 衰退期：此期细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，细胞形态轮廓增强，最后衰退死亡。*在以上三期任何一点，由于不明原因的影响（少数情况），细胞可能发生自发转化（spontaneous transformation）。,细胞发生转化的标志：细胞获得永生性(immortality)或恶性性(malignancy)。细胞永生性也称不死性，即细胞获得持久增殖能力。这样的细胞群体称无限细胞系，或连续细胞系（continuous cell line）。,细胞获得永生性,（二）组织培养细胞一代生长过程（一代生存期）细胞“一代”：仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间，它与细胞倍增一代非同一含义。在细胞一代中，细胞能倍增36次。,潜伏期（latent phase）:刚接种后的细胞在培养液中呈悬浮状态，又称悬浮期。此时，细胞质回缩，胞体变圆。接着细胞开始附着式贴附，初代培养细胞贴附慢。连续细胞系贴附快，（10秒30秒）,指数增生期 是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相多，此期的细胞分裂数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。初代细胞分裂指数低，连续细胞系和肿瘤系的分裂指数高，可达3-5%。指数增生期是细胞一代中活动最好的时间，因此是进行实验的最好和最重要的阶段。,停滞期(Stagnate Phase)又称平顶期 细胞数量达到饱和密度后，细胞逐渐停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量持平，故又称平顶期。,潜伏期,指数增生期,细胞增殖率极限点,细胞数增大极限点,平顶期,退化死亡,细胞增殖数,24 48 72 96 120h,细胞一代生长过程,培养细胞生存环境、条件和代谢 一、无污染环境 培养环境的无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。无菌的基本要求：*无菌室*超净台*无菌操作,二、温度 维持细胞增殖生长，必须有适当的温度。细胞对温度的耐受力：总的来说对低温的耐受比高温强。即：培养细胞的代谢随温度降低而缓慢一般要求在：36.6-37,三、气体环境和氢离子浓度：气体也是细胞生存的必须条件之一，主要有O2和CO2。O2：参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长，增殖和合成各种所需成分。某些细胞在乏氧情况下可借糖酵解来获取能量，但大多数细胞缺氧不能生存。CO2:既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分。它的主要作用在于能维持培养基的PH值。,pH：大多数细胞的最适pH值为7.27.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同。如：原代培养细胞：对pH 变动耐受性差。永生型细胞：耐受性强。恶 性细胞：还有：细胞的耐酸性比耐碱性要大一些。,四、体外培养细胞生存所需基本物质 凡能进入细胞中被细胞所利用，