《细胞培养基本知识》PPT课件.ppt

细胞培养,2011/11/11申艳娜,教材 细胞培养（Cell culture）司徒镇强任教老师 申艳娜 岳丹 李晓蕾 授课 6次理论课+2次实验课,细胞培养,细胞培养(cell culture):动植物细胞在体外培养的条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。细胞培养分为动物细胞培养和植物细胞培养，其中动物细胞培养是指在体外无菌条件下，模拟体内正常生理状态下的基本条件和环境，分离培养机体组织细胞或建立细胞系，并使得细胞在体外培养容器中长期生长或繁殖的方法。,应用领域广泛,病毒学免疫学遗传学肿瘤学分化及发育细胞毒试验临床医学及生物技术,第一章 细胞培养的基本知识 1.掌握培养细胞的生长特点和生长条件。2.熟悉培养细胞的特性。第二章 细胞培养室的设置、设备和准备工作 1.掌握细胞培养实验室的设备使用方法和保养。2.掌握实验器材的清洗和消毒灭菌方法。3.了解细胞培养实验室的设置。,细胞培养的基本知识,体外培养细胞的分型,贴附型,大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：成纤维细胞上皮型细胞游走细胞型多型细胞型,1、成纤维细胞型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等 的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状 细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维 样细胞，常有几个伸长的细胞突起,成纤维细胞,HUVECs人脐静脉内皮细胞1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；2.培养的天数：4d；原代培养；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：DMEM+15胎牛 血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。,骨髓间充质干细胞1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；2.培养天数：7天；3.放大倍数：200倍，倒置显微镜；4.培养基种类：DF12+10FBS；5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。,2、上皮型细胞,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,上皮型细胞,SKOv3（卵巢癌细胞）1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养的天数：传代后3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生 长，生长速度较快。,CCL-1491.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；2.培养的天数：1d（种在48孔板中）；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，34天传代一次，Giemsa染色。,3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,CNE11.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系；2.培养的天数：3d；3.放大倍速：相差100；4.培养基种类：PMI1640+10%CS；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，梭型成团生长。,4、多型细胞型,有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,SD大鼠神经元 原代1.细胞种类：脑皮质细胞；2.培养的天数：4-5天；3.放大倍速：电镜20000；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清+10%马 血清；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴 突和树突。,悬浮型,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),HL-60 分化细胞Giemsa染色1.细胞种类：HL-60；2.培养的天数：ATRA 1微摩尔作用5天；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：1640+8胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或 消失，胞核呈杆状或分叶状。,KU8121.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,HeLa细胞1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养；2.培养的天数：7d；3.放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。,K562细胞1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,每代贴壁细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,细胞传代方法,首次传代注意事项,细胞生长密度不高时，不能急于传代 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 吹打已消化的细胞应减少机械损伤 首次传代时细胞接种数量要多一些 首次传代培养的pH应偏低些 小牛血清浓度可加大至15%20%左右,细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数,细胞计数步骤,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。细胞数/ml4大格细胞总数/4104注意：压线细胞只计左侧和上方的。镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,细胞培养室的设置、设备和准备工作,细胞培养室的设置,无菌操作区：无菌操作室、净化工作台孵育区：孵箱制备区：培养液及有关培养用液的制备储藏区：各类冰箱、干燥箱、液氮罐清洗和消毒灭菌区：清洗、高压锅,细胞培养室常用基本设备,仪器：显微镜、培养箱、干燥箱、水纯化 装置、冰箱、细胞冷冻储存器、离 心机及天平、消毒器、滤器 培养用器皿：培养瓶、培养板、培养皿培养操作有关器皿：贮液瓶、吸管、加样器 器械：用于解剖、取材、剪切组织特殊设备：酶标仪、超低温冰箱、荧光显微镜 旋转培养器、流式细胞仪,细胞培养室主要设备讲解,净化工作台安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内使用前75%酒精擦洗台面，紫外灯照射30分钟，启动风机运转两分钟后再进行培养操作净化工作区内不存放物品，保持洁净气流流型不受干扰3-6个月更换初效无纺布，3年更换高效过滤器使用完毕，清理台面上的物品，75%酒精擦洗台面定期进行功能测试，检查净化台各项工作指标是否达标,细胞培养的实验用品,细胞培养瓶 25平方厘米，正方斜颈25平方厘米，三角斜颈75平方厘米，正方斜颈75平方厘米，三角斜颈150平方厘米，正方斜颈,细胞培养板6孔，12孔，24孔，48孔96孔,细胞培养皿35mm60mm100mm,冻存管1.2ml 2ml，5ml,离心管15ml50ml细胞刮器,滤 器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。,液氮罐,常用培养器皿及清洗,玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。,消毒前包装,常用的包装材料 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔,火焰消毒,在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶滴管、试管、吸管,培养用品的消毒灭菌,干热消毒：玻璃器皿 160 90-120分钟 湿热消毒：布类、金属器械、玻璃器皿：15磅20分钟 常规使用液体：15磅15分钟 橡胶用品：10磅10分钟 紫外线消毒：实验室空气、操作台表面、桌椅等 照射半径2.5米 过滤除菌消毒：血清、合成培养液、酶等 消毒剂及抗菌素：75%酒精、过氧乙酸、乳酸、青链霉素 其它：电子消毒器、钴60照射,谢 谢！,