《纳米基因药物》PPT课件.ppt

1,纳米基因药物NANO GENE MEDICINE,朱俊铭Dec.2009,2,Index,1概述2纳米脂质体3阳离子聚合物4树状大分子5病毒载体,3,1概述,基因工程药物基因治疗与基因药物基因转导方法非病毒纳米基因载体,4,1.1 基因工程药物,Monoclone Antibody,Vaccine,Therapeutic Protein,Interferon,Growth Factor,Interleukin,Solvable Receptor,Antisense Gene,Human Growth Hormone,Tissue Plasminogen Activator,Colony Stimulating Factor,Erythropoietin,Macromolecule Recombinant Carrier Cell Expression Purification Formulation,5,1.2 基因治疗与基因药物,广义：将遗传物质导入人体组织或细胞达到预防和治疗疾病的目的狭义：对人体遗传物质进行修正、补充或改造来达到治疗疾病的目的,基因治疗,基因药物用于基因治疗的药物,6,1.3 基因转导方法,电穿透、显微注射、基因枪、碳化硅纤维介导,Chemical,Physical,Biological,磷酸钙沉淀、DEAE介导、聚乙二醇介导、脂质体介导,病毒载体、胚胎干细胞,7,1.4 非病毒纳米基因载体,阳离子聚合物,脂质体,壳聚糖、多聚赖氨酸、树状大分子,8,2纳米脂质体,优势：易降解，毒副作用小，可反复给药 制备简单，重复性好，可大量生产 不激活癌基因，不激活免疫反应 保护药物不被降解 可有效转运，操作简单快速不足：缺乏靶向性 透膜能力低 在血浆中稳定性差,阳离子纳米脂质体聚阳离子纳米脂质体免疫纳米脂质体中融合纳米脂质体pH敏感纳米脂质体长循环纳米脂质体,9,2.1 阳离子纳米脂质体的组成,1987年，Felgner，DOTMA+DOPELipofectin,阳离子纳米脂质体 阳离子脂质+中性辅助脂质,1.阳离子脂质,10,2.1 阳离子纳米脂质体的组成,1.阳离子脂质,11,2.1 阳离子纳米脂质体的组成,1.阳离子脂质,12,2.1 阳离子纳米脂质体的组成,2.辅助脂质 磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)聚赖氨酸(PLL)、硫酸鱼精蛋白(PS),13,2.2 阳离子纳米脂质体的结构,小单层纳米脂质体(SUVs)20100nm大单层纳米脂质体(LUVs)100nm多层纳米脂质体(MLVs)300700nm 少层脂质体 已经商品化的阳离子脂质体Lipofectin TransfectACE LipofectAMINE(GIBCO BRL)Transfectam TfxTM-50(Promega)DC-Chol(Sigma)DOTAP(Boehringer Mannheim),14,2.2 阳离子纳米脂质体的结构,SUVs or LUVs,MLVs,15,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,16,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,17,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,阳离子纳米脂质体与基因形成复合物复合物的形成及结构(2)复合物的理化性质 SIZE 电位 胶体化学稳定性 影响因素脂质体与DNA浓度 介质的离子强度与温度 样品加入顺序、混合速率,静电模型内含模型细面条模型Radler模型“蜂窝”模型,18,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,19,20,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,2.阳离子纳米脂质体DNA复合物与细胞外物质的相互作用,相互作用的物质血液成分（RBC、蛋白质、脂蛋白）细胞外介质（糖蛋白、CS、胶原）黏膜分泌物（透明质酸、黏蛋白）表现聚集（脂质融合、电位降低、静电排斥力降低）转染效率低（DNA提前释放、酶降解）肺部蓄积和表达（第一毛细血管床）,21,2.3 阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制,3.阳离子纳米脂质体DNA复合物在细胞内转运,进入细胞细胞内吞作用内涵体初级溶酶体 与质膜直接融合Rhodanine标记 小孔模式 复合物修饰脱离内涵体DOPE很好融合性复合物与内涵体膜融合DNA向核转运微丝微管作用复合物分解内源性阴离子脂质方向突变 or DNA游离细胞核摄取DNA被动扩散 or 主动转运,22,2.4 纳米脂质体在基因治疗中的应用,1.在肿瘤治疗方面的应用 广泛应用于介导肿瘤治疗，动物实验或临床 黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌 HLA B7+DC-Chol/DOPE IV期恶性黑色素瘤(DMRIE/DOPE)E1A+DC-Chol/DOPE 乳腺癌 p53+DOTAP/Chol 小鼠实验性肺癌,23,2.4 纳米脂质体在基因治疗中的应用,2.在治疗肺部和呼吸道疾病中的应用 肺上皮表面基因表达水平最高的靶器官 肺囊性纤维化（CF）常染色体隐性遗传综合征 囊性纤维化跨膜传导调节因子 CFTR cDNA+DOTAP/DOPE DC-Chol/DOPE 部分患者出现炎性综合征,24,2.4 纳米脂质体在基因治疗中的应用,3.在治疗神经系统疾病中的应用 豚鼠耳蜗显微注射纳米脂质体/DNA复合物 感觉神经上皮持续表达14d，无毒性和炎症反应 大鼠脑缺血 pCMV-bcl-2 阳离子脂质体 48h，梗死面积、梗死区域凋亡细胞明显减少,4.在治疗机体炎症损伤方面的应用 急性胰腺炎大鼠 pcDNA3-hIL-10/阳离子纳米脂质体 7d后，存活70%，对照存活10%中性粒细胞抑制因子（NIF）/阳离子脂质体 特异性2整合素结合蛋白调节PMN阻止上皮损伤,25,3阳离子聚合物,阳离子聚合物聚阳离子表面带正电高分子聚合物 多肽类：聚赖氨酸PLL、聚谷氨酸PGA及其衍生物 多聚胺类：聚乙烯亚胺PEI、聚丙烯亚胺树状大分子PPI 聚甲基丙烯酸类：聚酰胺-胺型树状大分子PAMAM、聚甲基丙烯酸乙酯2-(二甲胺)阳离子聚酯 阳离子聚磷酸酯 聚乙烯吡啶盐 壳聚糖 明胶,优点：体内化学惰性+生物相容性 粒径和表面性质可控载体生理行为 特殊结构与表面电荷基因转移效率高 聚合物基质降解速率可控遗传物释放,26,3.1 阳离子聚合物/DNA纳米复合物的形成,DNA链状聚阴离子(PA)聚阳离子(PC),聚电解质纳米复合物,静电作用,过量的聚阳离子(PC)复合物PC逐步加入到DNA溶液中更好地定位DNApH、温度升高复合物MW、SIZE变大复合物可降低PC的毒性,27,3.2 聚合物/DNA纳米复合物的修饰,网状内皮系统(RES)对复合物的吞噬作用各类血浆物质和聚阴离子 与 复合物作用聚乙二醇(PEG)、混合磷脂、非离子表面活性剂、IgA、血清成分基因治疗靶向性靶向配基：半乳糖化蛋白、转铁蛋白、结合多肽、叶酸、抗体,28,3.3 阳离子聚合物介导转染的机制,进入细胞细胞内吞作用内涵体细胞核促进膜分解的多肽+聚赖氨酸 转染效率比聚赖氨酸提高101000倍提高内涵体pH值避免溶酶体对复合物降解提高转染效率,29,3.4 常见的阳离子聚合物载体,1.聚赖氨酸类载体 聚-L-赖氨酸类载体PLL2050nm圆突体，4080nm棒状 转染效率不高，聚集，易被排除，细胞毒性 唾液血清粘蛋白、转铁蛋白、叶酸、单抗修饰 PEG、葡聚糖与PLL共聚，提高体内稳定性、转染效率 其他氨基酸聚合物载体鱼精蛋白、亚精胺、组蛋白 鸟氨酸均聚物（PLO）转染校比PLL高10%聚谷氨酸，可生物降解性，低红细胞毒性,30,31,3.4 常见的阳离子聚合物载体,2.壳聚糖类载体 壳聚糖甲壳素碱性条件水解脱去部分乙酰基 聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖胺 壳聚糖/DNA纳米复合物制备与特性 天然材料无毒，良好生物相容性，游离的氨基可质子化 共凝聚胶态复合物（硫酸钠）粒径大小N/P比，壳聚糖分子量 壳聚糖/DNA纳米粒子稳定性交联键、pH 壳聚糖及其衍生物的转染作用 细胞类型、培养介质、pH、壳聚糖分子质量、,32,3.4 常见的阳离子聚合物载体,3.聚乙烯亚胺类载体 PEI 特点线型、支链型 pKa质子化能力溶液浓度 DNA压缩程度N/P PEI/DNA复合物管状胶束、圆突形 较多正电荷毒副作用 PEG化或修饰可解决此问题 转染作用PEI相对分子质量（25kD800kD）（1.8kD）进入融酶体后，未完全质子化复合物结合H+pH 叶酸具有特殊的加强复合物转染活性的能力 folate-PEG-PEI/DNA无毒、高转染活性 乳糖、半乳糖、脱辅基蛋白E靶向性,33,4树状大分子,1980s，美国化学家Tomalia博士发明,34,4.1 树状大分子的合成方法,发散法会聚法PAMAM、PPI,35,4.2 树状大分子/DNA纳米复合物的形成,静电引力复合物形成高度压缩DNA保护DNA粒径50100nmN/P20溶于水低密度复合物电荷密度代数DNA10ng/mol复合物悬浮于水,36,4.3 树状大分子基因载体的转染作用,转染机制相同复合物可使胞膜出现1540nm小孔特点高稳定性、高溶解性 缓冲pH值热处理活化提高转染效率（分枝含氨基）可控分子大小、形状、电荷、pKa、N/P比离体治疗角膜内皮C、肿瘤C、鼠心脏C、兔颈动脉C问题受免疫系统监控、聚阴离子攻击 PEG、混合磷脂、非表面活性剂、IgA、血清成分修饰 环化糊精,37,4.4 树状大分子的毒性,复合物毒性低于树状大分子细胞毒性细胞膜损伤、溶血细胞毒性随代数增加而增加，随电荷密度增加而增加多余阳性电荷活化补体系统N/P聚氧乙烯和硅烷的树状共聚物(Csi-POE)COONa端基树状大分子PEG修饰、脂质体包裹可降低毒性,无溶血毒性、细胞毒性,38,5病毒载体,逆转录病毒（RV）腺病毒（Ad）腺相关病毒（AAV）痘苗病毒（VV）单纯疱疹病毒（HSV）,39,小结,粒径nm级一般带阳离子通过静电作用与DNA形成复合物提高转染效率粒径、N/P比、分子质量转染机制吞饮内涵体微管胞核受环境条件影响免疫系统、血浆成分细胞毒性聚集、细胞膜损伤修饰可提高转染效率、降低毒性,40,Thank you!,