《真菌诊治进展》PPT课件.ppt

真菌感染的非培养诊断进展,北京大学第一医院皮肤科北京大学真菌和真菌病研究中心李若瑜2008年2月27日,真菌感染的流行现状,真菌感染不断增加的原因 高危人群的增多,条件致病菌,机会来了！,Martin et al,NEJM 2003;348:1546,脓毒血症的发病率,Edmond et al.Clin.Infect.Dis.(1999).29:239-244,Nosocomial bloodstream infections in hospitals in the USA重要致病菌流行病学监测和控制（SCOPE）计划 1995-1998,念珠菌血行感染发病率和死亡率高,1950,1960,1970,1980,1990,2000,IA,ASP,侵袭性曲霉病的发病率也在增加,Kontoyiannis et al.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002，21:161-172Warnock.JAC,1998,41(suppl D):95-105,Aspergillus spp.,Candida spp.,All other,Prevalence at Autopsy%,Groll et al,J Infect 1996;33:23-32.,经尸检证实的侵袭性真菌感染,54.84%,12.9%,3.23%,9.68%,19.35%,西南医院尸解资料，(1971-2000)，郝飞教授提供,Aspergillus,Cryptococcus,Mucor,Candida,All others,曲霉感染:日益严重的问题,曲霉是继念珠菌之后的第二常见真菌病原体虽然经过治疗，免疫抑制患者的死亡率仍达90%,Andriole VT.J Antimicrob Chemother 1999;44:151-162;Groll AH et al.Adv Pharmacol 1998;44:343-500;Denning DW.Clin Infect Dis 1998;26:781-805;Andriole VT.Curr Clin Top Infect Dis 1998;18:19-36;Lin S-J et al.Clin Infect Dis 2001;32:358-366;Paterson DL,Singh N.Medicine(Baltimore)1999;78:123-138.,非白念珠菌的增多.,非白念珠菌(46.8%),白念珠菌(53.2%),Edmond et al.Clin Infect Dis 1999;29:239-44.,934例念珠菌血症,1,3,2,C.glabrata42.3%,C.parapsilosis21.1%,C.tropicalis26.1%,非白念念珠菌血症,Edmond et al.Clin Infect Dis 1999;29:239-44.,美国血源性念珠菌感染种类分布(1998-2000),Hajjeh et al.(2004)J.Clin.Microbiol.42(4):1519-1527,Other,1.12%,C.lusitaneae,1.02%,C.krusei,2.04%,C.tropicalis,12.23%,C.parapsilosis,13.25%,C.glabrata,24.46%,C.albicans,45.87%,.,我国念珠菌种类的变化,菌种 85-92%96-2002%白念珠菌 80-90 43-75热带念珠菌 10-13 10-15光滑念珠菌 1-6 14-21克柔念珠菌 1 5-27葡萄牙念珠菌 1 2-5新型隐球菌 1 1-5,菌名株数SSDDR%白念珠菌38833 98.40.70.8近平滑念珠菌 2628 93.84.41.8 热带念珠菌 2990 92.54.92.6葡萄芽念珠菌 27493.43.33.3新型隐球菌 68889.14.86.1念珠菌属258381.210.78.1季也蒙念珠菌 36578.612.98.5其它念珠菌115875.311.313.4光滑念珠菌561165.520.114.4克柔念珠菌1206 17.731.150.7,常见酵母菌对氟康唑的敏感性,临床常见的条件性真菌感染,念珠菌病:最常见，占血源感染的第4位。曲霉菌病:常见于血液系统恶性肿瘤病人，器官移植常见合并症。隐球菌病:在艾滋病人发病率为10-20%。接合菌病（毛霉病）:多见于重症糖尿病和烧伤病人。,临床有增多趋势的条件性真菌,非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染镰刀菌感染枝顶孢霉感染暗色真菌感染马尔尼菲青霉,种特异性,属特异性,真菌通用,真菌感染的非培养诊断,非培养诊断检测方法,G试验检测b-1,3 D-葡聚糖ELISA法检测曲霉半乳甘露聚糖抗原乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原ELISA法检测念珠菌抗原PCR_真菌通用引物、种属特异性引物,1,3-D-glucan（葡聚糖）,真菌细胞壁成份，占50%以上其他微生物、动物及人的细胞不含该成份主要用于念珠菌和曲霉菌感染诊断,方法：G试验,-葡聚糖可特异性激活鲎（Limulus）变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。-b-1,3-D-葡聚糖通过激活G因子（Factor G）引起凝集；内毒素通过激活C因子（Factor C）引起凝集；试剂盒:祛除Factor C 葡聚糖特异,-1,3-D-葡聚糖检测方法,两种试剂盒Fungitec-G(marketed in Japan)Obayashi,Lancet 345:17-20,95“确诊真菌感染的患者”:90%sensitiveGlucatell(approaching US licensure)Ostrosky多中心研究 189 侵袭性真菌感染高危的患者*每名患者取材1次:Sensitivity:70%;Specificity 87%.界值：Fungitec:20 pg/mL Fungitell:60/80 pg/mL 金山川公司G试剂:50 pg/mL,-1,3-D-葡聚糖 检测范围,不仅可检测念珠菌感染曲霉、镰刀菌 和很多霉菌均存在-1,3葡聚糖(Miyazaki,J Clin Micro 33:3115,95)隐球菌细胞壁为alpha-葡聚糖,故为阴性阳性结果只能代表存在侵袭性真菌感染,不能确定种类,Clin Infect Dis 2004;39:199-205,侵袭性真菌感染中葡聚糖检测,AML,MDSReceiving antifungal prophylaxis,Cut off60 pg/ml,Clin Infect Dis 2004;39:199-205.,30,30,with candidemia,control subjects,侵袭性真菌感染的葡聚糖检测Fungitell assay,假阳性原因,*内毒素：NaOH预处理*抗肿瘤药：香菇糖、裂殖菌多糖*免疫治疗：白蛋白、球蛋白*血液透析中使用硝酸纤维素制品*术中使用棉制品、海绵等*血红蛋白细菌及真菌定植状态不影响G试验Pickering J,et al.J Clin Microbiol 2005;43:595762,假阴性原因,体液中存在葡聚糖酶使BDG降解。Kawai R et al.2006，Appl Microbiol Biotechnol 71:898906,成人急性髓内白血病，慢性淋巴细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，骨髓发育不良综合症，非霍奇金淋巴瘤。疑有内源性真菌内眼炎的患者 术后病重患者 中暑患者农民肺Imai K et al.2004，Nihon Kokyuki GakkaiZasshi 42:10241029肺曲霉病患者卡氏肺囊虫肺炎患者 其他确诊或疑似侵袭性真菌感染的患者Kdzierska et al.Eur J Clin Microbiol Infect Dis(2007)26:755766,应用对象：,检测曲霉半乳甘露聚糖抗原（GM）,检测位于曲霉细胞壁上的 galactomannan,（GM）3.Detection avidin-enzyme+substrate2.Detecting Ab anti-galactomannan biotin conjugatedAg blood,urine,BAL1.Capture antibody monoclonal anti-galactomannan,Specificity=90%sensitivity=75%,A 酶联免疫吸附法（Platelia Aspergillus-EIA）(PA-EIA Platelia Aspergillus,Bio-Rad,Marnes-la-Coquette,France)欧洲已流行近十年，在美国03年刚被批准。B 乳胶凝集试验（Latex agglutination）(LA Pastorex Aspergillus,Bio-Rad,Marnes-la-Coquette,France)两种方法比较，前者比后者更有效：*0.51 ng/mL Vs 15ng/mL。*早5天检测到Keutgen X et al,Eur J Clin Microbiol Infect Dis.2007,GM抗原的检测方法,曲霉的GM 抗原检测,乳胶凝集试验（Pastorex）(15ng/ml)酶连免疫吸附试验（Platelia）(1ng/ml),Sabetta et al.JID 1985;152:946Ansorg et al.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;13:582Verweij et al.JCM 1995;33:3150Maertens et al.Blood 2001;97:1604Herbrecht et al.J Clin Oncol 2002;20:1898,预处理：*EDTA作预处理，分解免疫复合物，沉淀蛋白*加热使免疫复合物失活。界值确定：*阳性0.5;阴性0.5;欧美已普遍接受（06年）。*将界值由1.5改为0.5，敏感性由76.3%提高到97.4%，特异度由97.5%降至90.5%。结果判读：*两次阳性可确诊感染。*重复检测阴性可排除真菌感染。Johan A et al,Clinical Infectious Diseases 2007;44:132936,GM试验注意事项,Platelia Aspergillus EIA 结果判断,GM不同Cutoffs值的敏感性和特异性,Marr KA et al,J Infect Dis 2004;190:641-9,*蘸有曲霉孢子的棉花、棉签*患者样本中儿童比例高(83%)：双歧杆菌的脂膜酸可与EB-A2抗体结合*破损的肠粘膜：不洁饮食携带的GM*肠外使用-内酰胺类抗生素：派拉西林、阿莫西林 Alban Aubry,et al,J CM 2006p.389394*细胞毒性药物：e.g.:环磷酰胺*移植物抗宿主病：存在与抗体结合的其它蛋白Hamaki et al,Bone Marrow Transplant.2001 Sep;28(6):633-4,假阳性:,Vale rio R et al,Mycopathologia(2007)163:191202,其它GM可能出现阳性的真菌,*抗体多Raoul Herbrecht et al,Journal of Clinical Oncology,Vol 20,No 7(April 1),2002*抗真菌药：两性霉素B、泊沙康唑、伊曲康唑 通过抑制菌丝生长从而减少GM的分泌。*感染部位：GM检测的敏感度在局限性感染 比侵袭性感染低：慢性肉芽肿。*侵血管性弱：菌丝少时*菌量少,假阴性：,（1）GM检测不仅利于疾病的确诊，也有助于指导用药。*用药后监测GM可评估药效及预后。*频率：2次/周。*适用对象:粒细胞减少、移植、长期用激素的患者（2）结合G试验可减少假阳性。（3）结合临床表现及其它辅助检查确诊。,应 用,GM 抗原,GM抗原ELISA检测应用（Platelia试剂盒）,48例患者：确诊IA4例，3例阳性；高度怀疑IA13例，8例阳性；可疑IA31例，2例阳性。,王，等。临床皮肤科杂志，2006。,灵敏性为64.7%特异性为93.5%假阳性率为6.5%假阴性率为35.3%,曲霉 GM 抗原系列监测,n=362 高危粒细胞缺乏病人Sandwich ELISA 2 times weekly,11.7%阳性n=30 proven IAn=9 probable IAn=264 with no IA敏感性89.7%特异性98.1%阳性预测值PPV87.5%阴性预测值NPV98.4%,Maertens J et al,Blood 2001;97:1604-10,曲霉感染检测的影响因素,半乳甘露聚糖在血中存在时间短，建议：高危人群每周至少检测2次，动态观察 结合影象学、培养结果综合分析诊断,假阴性,假阳性,哌拉西林/他唑巴坦与其它细菌或真菌成分有交叉反应 肠道中定植的曲霉释放GM进入血液循环 含有谷物的食物中存在GM抗原，通过受损肠黏膜进入血循环导致抗原血症，化疗后出现严重黏膜炎的更易发生,检测真菌DNA的PCR试验,标本：全血血清活检组织BALCSF,不同方法：DNA 提取 PCR 设计 产物检测,PCR,PCR技术用于诊断,种特异-PCR非特异 PCR杂交,Standart singlenestedPCR-EIAReal-time,标本全血血浆血清BAL,最低检测范围4-10 cfu/ml25-100 fg DNA,原位杂交,目的基因多拷贝基因,PCR 检测和鉴定多引物多样本制备高敏感度:1-100 cells/mlpan-fungal PCR敏感度：100%(多个标本)与治疗一致,J Clin Microbiol 1997;35:1353-60,SPEED,PCR过筛试验诊断IA,每周监测2次通用引物;确定采用巢式和实时定量;敏感性100%,特异性65%;早于临床症状2天,早于确诊9天;动态观察持续阴性可排除;,Dr.Maschmeyer G.in 2nd Trends in Medical Mycology,23-26 October 2005,Berlin,Germany.,DNA 扩增,种/属特异性序列HSP 90 羊毛固醇脱甲基酶 几丁质合成酶 天冬氨酸蛋白酶 actin 高度保守序列18S rRNA gene 28S rRNA gene线粒体,单拷贝gene巢氏PCR,多拷贝 genes,Jun Zhao et al.JCM 2001,Nested PCR in Animal Models,余进，等。中华检验医学杂志，2003,种特异引物巢式 PCR扩增烟曲霉rRNA基因,动物模型中巢式PCR方法检测的灵敏度,灵敏度=77.8%,余进，等。中华检验医学杂志，2003,完成全基因序列测定的病原真菌,白念珠菌等致病性念珠菌新生隐球菌粗球孢子菌烟曲霉、构巢曲霉等数种曲霉组织胞浆菌卡氏肺孢子菌,突破方向,对基因组序列和功能的了解，找出特异处改进目前方法，提高敏感性Real-time PCR多重PCR芯片技术其它特异抗原,DNA 微阵列,芯片、探针:Candida spp.Aspergillus spp.临床标本:10-20 cfu/ml body fluid PCR electrophoresis:75.6%DNA microarray:87.9%Zhu et al.AAA.San Francisco,9-12th September 2004,真菌非培养诊断小结,在诊断侵袭性真菌感染有一定价值，尤其早期诊断和疗效监测理想的检测方法尚少隐球菌乳胶凝集曲霉GMG试验PCR方法有待标准化多次取材重要结合临床表现、真菌学等传统方法和影象学,真菌病诊断,感染病学家,真菌学家,生产研发者,联系方式:,6551122-3056,谢谢大家!,