《目的基因的分离》PPT课件.ppt
二、利用PCR扩增目的基因1.巢式PCR(nested PCR)巢式PCR是指利用两对PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的序列很少）增加了扩增的可靠性和敏感性。若用于检测则可增加检测的可靠性。,2.反向PCR(Inverse PCR)用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。应用：（1）用于测序的DNA大片段的克隆（2）获得启动子序列（3）小质粒的定点突变（4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,反向PCR示意图,3.不对称PCR(asymmetric PCR)引物浓度不相等，比例为50:1或100:1。在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。产生的单链DNA主要用于DNA测序。,高浓度引物,低浓度引物,4.锚定PCR(anchored PCR)通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列,用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（Poly G）的尾巴，然后分别用多聚dC(Poly C)和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚定引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾poly(dG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制酶识别位点polydC)一起作PCR扩增,cDNA末端的快速扩增（rapid amplification of cDNA end,RACE)(a)5RACE：,GSP3,设计引物，合成cDNA第一链,AP,AAAAA.AAAAn,TTTTT.TTTT,5,用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链,TTTTT.TTTT,GSP1,AUAP,GSP2,(b)3RACE,特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增,5.长程PCR(long and accurated PCR,LA PCR)选用TaKaRa的LA Taq DNA聚合酶或Ex Taq DNA聚合酶。具有35校对功能，可信度高。扩增长度长。,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,6.逆转录PCR(RT-PCR),RT-PCR,RT-PCR,7.Alu PCR Alu序列是人类基因组中的高度重复序列，遍布于全基因组中，两个Alu序列间隔约4 kb。根据Alu序列的高度保守区域设计引物，扩增Alu重复序列间的未知区域的PCR称为Alu PCR。,设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,图1 第1、2、3组引物多重PCR电泳图 1：正常对照；2：DL2000 marker；310：检出的缺失型患者,杜氏/贝克型肌营养不良症,一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点,原位PCR(In Situ PCR),原位PCR是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。,差示PCR,differential PCR,d-PCR d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于一个试管中进行PCR，电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度，或在引物5端标记上放射性同位素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。现在的PCR定量方法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量，即荧光定量PCR。,差示PCR,免疫PCR(Immuno PCR)免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子，电泳定性，根据特异性PCR产物的有无，来判断待测抗原是否存在。免疫PCR集PCR的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度低至2 ng/L的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。,免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA)包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素(ProteinA-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA)(Biotin-pUC19)中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。,
