《电泳技术复》PPT课件.ppt

电泳技术刘松财2011,本章的主要内容,一、概念 电泳（Electrophoresis）：在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。,二、电泳分类 电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。区带电泳的分类如下：,1按支持物物理性状不同，可分为：(1)滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。(2)粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。(3)凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。(4)丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。,2按支持物的装置形式不同，可分为：(1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。(2)垂直板式电泳。,3按pH的连续性不同，可分为：(1)连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。(2)非(不)连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。,三、电泳的基本原理 电泳(Electrophoresis)是指带电荷的胶体粒子在电场作用下的定向移动现象。氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等具有可解离基团，在溶液中能够形成带电荷的离子，不同物质由于带电性质不同，因而在一定电场强度下移动速度不同。不同的带电颗粒在同一电场中的泳动速度不同，常用迁移率或泳动速度表示。迁移率的定义为带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。,式中：m为迁移率(厘米/伏特秒)；v为颗粒的泳动速度(厘米/秒)；E为电场强度(伏特/米)；d为颗粒泳动的距离(厘米)；l为支持物的有效长度(厘米)，即载体与两极溶液交界面间的距离；V为实际电压(伏特)；t为通电时间(秒)。通过测量d、l、V，t便可计算出颗粒的迁移率。,带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量，颗粒大小和形状有关。一般说来，所带净电荷量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中的泳动速度愈快，反之则愈慢。泳动速度除了受颗粒本身性质的影响外，还和其它外界因素有关，它们之间的相互关系可用下式表示：,由上式可以看出泳动速度与电动电势(Z)、电场强度(E)及介质的介电常数(D)成正比，与溶液的粘度成（Cn）反比。式中C为一个常数，其数值为49，由颗粒大小所决定。,在正常情况下进行电泳时，胶体粘度，介电常数及电势梯度都在同一条件下，故胶体分子大小及其所带电荷多少，决定其泳动速度。由于样品中各种蛋白质的分子量不同，等电点不同，所带电荷多少亦不相同，在一定条件下各种蛋白质的泳动速度(迁移率)各异。,影响迁移率的因素有如下几个方面：,1.样品 带电颗粒本身的性质在几个方面影响着它的迁移率(1)电荷：迁移率随着带电颗粒净电荷的增加而增加，电荷量的大小一般由pH决定。(2)大小：对于较大的分子，由于周围介质所引起的摩擦力和静电引力的增加，迁移率下降。(3)形状 同样大小，但具有不同形状的分子，如纤维状蛋白质和球状蛋白质，因摩擦力和静电引力的不同，而表现出不同的迁移率。,2.电场 根据实验的需要，电泳可分为两种，一种是常压电泳，电压在500伏特以下，分离时间较长。另一种是高压电泳，电压为1000伏特以上，电泳时间很短，有时仅需数分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等生物大分子物质；高压电泳则多用来分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。,欧姆定律表示了电流(A)、电压(V)和电阻()之间的关系：Av/(1)电流 迁移率与电流成正比。带电颗粒迁移的距离与通电时间也成正比。电泳时必须保持电流的恒定。(2)电压 电压控制着电流，因此迁移率与加在支持介质两端的电位差(端电压)成正比。(3)电阻 迁移率与电阻成反比,3.缓冲液,(1)成分(2)pH 溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。(3)离子强度 一般最适的离子强度在0.020.2之间,4.电渗,电泳时，滤纸、醋酸纤维素薄膜等支持物在缓冲液中都带有负电荷，而与这些支持物接触的水溶液则带正电荷(静电吸引)。电泳时，由于滤纸、醋纤膜等固定不动，于是带正电荷的水就流向负极，并携带颗粒也起向负极移动。由于电渗现象与电泳作用同时存在，当电泳方向与电渗方向致时，其蛋白迁移的距离等于两者相加之和；若两者方向相反时，则颗粒的泳动距离为电泳的距离减去电渗的距离。,凝胶电泳的支持介质：,固体支持介质可以分两类：一类是纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、纤维素等。这些介质相对来说是化学惰性的，能将对流减到最小。另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙酰胺凝胶。这些凝胶介质不仅能防止对流，扩散最小，而且它们是多孔介质，孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，因而具有分子筛的作用。因而在进行分离时不仅取决于分子的电荷密度，还取决于分子的大小。,聚丙烯酰胺是通过丙烯酰胺和N、N-亚甲双丙烯酰胶在适当的游离基催化加速制作用下聚合而成的。催化加速剂一般是0.10.3(W/V)的过硫酸铵与0.10.3(W/V)的-二甲氨基丙腈(DMAP)或N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)。凝胶的孔径由丙烯酰胺单体和交联剂N，N-亚甲双丙烯酰胺的相对比例决定。,一般来说，不同分子量的蛋白质，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中所选择的凝胶浓度不同，详见下表。,电泳的操作过程,(1)支持介质的饱和(2)加样(3)样品的分离(4)取出支持介质(5)染色和物质的回收,几种染科,1氨基黑10B 氨基黑10BC22H13O12N6S3Na3，MW=715，max=620nm-630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐,氨基黑染不同蛋白质的着色度不等、色调不一(有蓝、黑、棕等),2考马斯亮蓝R250 C45H44O8H3S2Na，MW=824，max=560nm-590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。,3考马斯克蓝G250比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW854，max=5,90nm-610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色,4银染色银染的机制是将蛋白带上的硝酸银离子还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。银染的灵敏度高，可以检测低于1 ng的蛋白质。,四、电泳技术的应用,生物分子纯度鉴定蛋白质分子量的测定蛋白质等电点的检测蛋白质的鉴定蛋白质组学核酸检测及序列测定,实验五人工合成牵引丝蛋白基因在原核细胞及Pichia 酵母细胞中的表达研究,生物分子纯度鉴定,蛋白质的鉴定,1 2 3 4 5 6 7,kDa 43.0 31.0 20.1 500,图8Western blot 检测目的蛋白在酵母细胞中的表达情况Fig.8 Western blot of the expressed products from pPICZC-nSpLane 12：Induced supernatant of pPICZC-Sp transformant；34：Induced supernatant of pPICZC-2Sp transformant；56：Induced supernatant of pPICZC-4Sp transformant；7：Low molecular weight protein marker.,实验三蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA重组酵母表达质粒的构建及其在Pichia酵母细胞中的表达,Fig 2.3 Digestion with EcoR I and Xho I1:pET-Lep M:DL-2000 marker,Fig 2.2 Identification of PCR1:Lepin M:DL-2000 marker,瘦蛋白原核表达载体的酶切与PCR鉴定,实 验 二 瘦蛋白基因在原核细胞中的表达及多克隆抗体的制备,Fig 2.5 SDS-PAGE of leptin inclusion bodies,leptin after purification and refolding.M:Low molecular weight protein standard weight;1:protein after refolding;2:purified protein;3:inclusion bodies;4:bacterial proteins;5:control,97kDa43kDa20kDa,M 1 2 3 4 5,包涵体蛋白的纯化、复性,实 验 二 瘦蛋白基因在原核细胞中的表达及多克隆抗体的制备,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,2-D Electrophoresis,The 1st D:Isoelectric Focusing,pH 3,pH 7.5,pH10,charge,size,The 2nd D:SDS-PAGE,Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.Smallest proteins travel the furthest distance,pI,M.Wt.,