《电泳分离技术》PPT课件.ppt

第十一章 电泳分离技术,广泛应用于各个科学领域的新型分离技术,概述,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,1809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白。,第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；,由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因而逐渐发展起了区带电泳。自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越来越广泛的应用。,电泳分析的特点,各种电泳技术具有如下特点：凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进行定性或定量分析；样品量极少；设备简单，可在常温下进行；操作简单省时；分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。,电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。,电泳的分类,1.电泳按其分离原理不同，分为区带电泳、移动界面电泳、等速电泳、等电聚焦电泳等。区带电泳自由界面电泳等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH出聚集成很窄的区带。,2.电泳按支持介质的不同，分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等。3.电泳按支持介质形状的不同，分为薄层电泳、板电泳、柱电泳等。4.按用途不同可分为分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连续制备电泳等。5.按所用电压不同可分为：低压电泳：100v500v，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。高压电泳：1000v5000v，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离,影响电泳速度的因素,颗粒性质：直径、形状、静电荷。电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：2-10V/cm溶液性质：电极溶液和蛋白质样品溶液pH、离子强度、溶液黏度。电渗：液体对固体支持物的相对移动。颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。支持介质的筛孔,V:泳动速度cm/秒or分d:泳动距离cmt:电泳时间(秒/分)E:电场强度 伏特/cm,u:泳动率or泳动度(cm/伏秒or分)U:电压 常压(100500v)高压(50010000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度),迁移率(mobility)：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.,凝胶电泳,主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖筛分作用小，适于大分子物质聚丙烯酰胺分离效果好，分辨率高，适于小分子物质,聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。PAGE是目前最常用的电泳方法。,原理,以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。,聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点,设备简单样品量小（1-100微克）时间短（30-60分钟）操作方便分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）可提高灵敏度改为超微量测定（10-1210-9）可用于蛋白质分子量测定,凝胶特性,机械性能、弹性、孔径大小等。T单体的总百分浓度 C交联百分浓度a丙烯酰胺的克数b亚甲基双丙烯酰胺克数m体积,聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加而降低。,有效孔径决定蛋白质的分离,聚合方式,光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。化学聚合：制小孔胶。过硫酸铵 APS(引发剂)N,N,N,N-四甲基乙二胺 TEMED(加速剂)被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。,特别注意,丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用.丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存.混合的溶液保存不宜超过一个月.,琼脂糖凝胶电泳,（一）优点1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性,（二）缺点1.易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。,主要性能指标,电内渗胶凝温度熔化温度凝胶强度脱水收缩作用,琼脂糖的选择,凝胶电泳的应用常规聚丙烯酰胺电泳,分子筛效应提高了分辨率各种大分子的分离研究生物大分子的特性可保持分离物的生物活性,缓冲系统的选择,pH值由于影响蛋白质的解离，在电泳过程中具有重要作用离子强度既要起到缓冲作用，同时还需产热少，对电流相对贡献小。一般选用较低的离子浓度。凝胶浓度的选择在于选择合适的孔径。浓缩胶分离胶 均一胶梯度胶染色方法常用考马斯亮蓝、溴酚蓝等。,理想显色剂的7S安全（safety）灵敏（sensitivity）简单（simplicity）特异性（specificity）快速（speed）稳定（stability）兼容性（synergy）,考马斯亮蓝R250：灵敏度是氨基黑10B的5倍，但不适用与酸溶蛋白、醇溶蛋白。考马斯亮蓝G250：灵敏度不如R250，但不溶于酸性溶液。考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍.,银染法,机制：将蛋白质带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓度成线性关系。蛋白质的染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，碱性和含硫氨基酸的存在对染色有贡献。银染应先固定，固定的作用有两个：第一是把蛋白质固定在凝胶中阻止扩散。第二为了除去干扰染色的物质，如去污剂、还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。染色分为双胺银染和非双胺银染。银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。,双胺银染过程：1.胶在50%甲醇中浸泡至少1小时.2.配制溶液A 0.8克硝酸银到4毫升无离子水。B21毫升0.36%氢氧化钠和1.4毫升14.8摩尔的氢氧化胺.3.将A滴到B中，用无离子水加至100毫升，此溶液临用前配制，染色15分钟.4.无离子水漂洗5分钟.5.显色液：2.5毫升1%柠檬酸与0.25毫升37%甲醛混合，加无离子水至500毫升。显色约10分钟，蛋白带出现。6.无离子水漂洗后用50%甲醇终止显色。,十二烷基硫酸钠（SDS）的聚丙酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是SDS能和蛋白质结合并使蛋白质带有大量的负电荷，大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白质分子间的电荷差别消除；同时通过断裂分子内和分子间的氢键，蛋白质的结构也在SDS作用下变得松散，形状趋于一致。排除了电泳过程中电荷的影响，使SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。,原理,在一定范围内，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。测定蛋白质相对分子质量时，用已知相对分子质量的蛋白质与被测样品在同一条件下进行电泳，最后计算出被测样品的分子量。由于蛋白质与SDS的结合对电泳影响显著，因此需要注意SDS单体浓度、离子强度等影响因素。用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。,蛋白质 Z 在左边的 native-PAGE 中无法向下泳动，但在右边的 SDS-PAGE 则可以依其分子量正确泳动；因此一般使用上，SDS-PAGE 的应用较广泛。在 SDS-PAGE 下，虽然 X 分子被解析成单元体，因此分子量由 160 kD 变成 40 kD；但若在较温和的样本处理件下，有可能看到未完全解析的 160 kD 蛋白质色带。,Staking gel,Separating gel,该方法可选择的缓冲液范围较广，主要影响蛋白质分离效率和电泳速度。,由于无电荷浓度的影响，因此凝胶浓度选择成为关键因素。,等电聚焦,等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。,蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。,双向电泳,1975年，OFarrell 首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。,双向电泳具有一些明显的优点可在不同电泳技术的基础上构建双向电泳,双向电泳的应用,低丰度蛋白质的检测蛋白质检测和分析蛋白质组学和代谢组学,毛细管电泳,毛细管电泳（capillary elecrophoresis,CE）是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：采用了0.05mm内径的毛细管；采用了高达数千伏的电压。,电极槽和进样系统,清洗系统,毛细管,检测器,铂电极,电极槽,恒温系统,记录和数据处理,毛细管电泳的特点,柱效高，可达105106/m分离速度快，几十秒几十分钟溶剂和试样消耗极少没有高压泵，仪器成本比HPLC更低选择性强,检测器,紫外/可见光检测器安培检测器MS,应用,测序,基因治疗与基因诊断,刑事侦查,单细胞分析,手性分离,小分子和离子分离,亲和毛细管电泳,指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子间，发生了特异性相互作用，形成受体-配体复合物，通过对比亲和作用发生前后的电泳图谱，可获得有关受体-配体亲和力大小、结构变化、作用产物等方面的信息。,毛细管电泳色谱,在毛细管中填充或在管壁涂布、键合色谱固定相，依靠电渗流推动流动相，溶质由于在色谱固定相和流动相间吸附与分配平衡常数的不同和电泳速率的不同而达到分离目的。,制备电泳综述,制备等点聚焦自由流动电泳梯度流系统多通道流动电泳,