《电泳技术》PPT课件.ppt

第四章 电泳技术,目 录,第一节 基本原理第二节 电泳的分类第三节 醋酸纤维素薄膜电泳第四节 琼脂糖凝胶电泳 第五节 聚丙烯酰胺凝胶电泳第六节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电泳 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象,第一节 基本原理,迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算：=/E=(d/t)/(V/l)=dl/Vt为迁移率（cm2V-1min-1）；为颗粒泳动速度（cms-1）；E为电场强度（Vcm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d,l,V,t,即可计算出被分离物质的迁移率。,1迁移率单位=10-5 cm2V-1min-1在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的化学特征常数,颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。迁移率还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，迁移率与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。,影响电泳速度的外界因素,1.电场强度 2.溶液的pH值 3.溶液的离子强度 4.电渗现象 5.温度的影响 6.支持物的影响,影响电泳速度的外界因素1.电场强度,电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。,影响电泳速度的外界因素2溶液的pH值,溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。,影响电泳速度的外界因素3.溶液的离子强度,电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，相成一个与运动粒子符号相反的离子氛（ionic atmosphere），它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。,离子的这种阻碍效应是与其浓度和价数相关的。用离子强度来表示，它的数值如下式：式中s表示共有s种离子，Ci和Zi分别代表每种离子的浓度（mol/L）和价数。,影响电泳速度的外界因素4.电渗现象,一个U形管的底部装上一块素烧瓷板（密封）,管中装入液体，并在两端加入电极通电，就会看到负极的液面上升。因为瓷板带有负电荷，液体相对地带有正电荷，因而向负极移动。这种液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。,影响电泳速度的外界因素5.温度的影响,电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。温度每升高1，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置,影响电泳速度的外界因素6.支持物的影响,对支持物的要求一般是均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离，实验结果及扫描图谱无法重复。,第二节 电泳的分类,一、按分离原理分类二、按有无固体支持物分类,电泳的分类一、按分离原理分类,区带电泳移界电泳等速电泳聚焦电泳四种,电泳的分类二、按有无固体支持物分类,第三节 醋酸纤维素薄膜电泳,一、原理以醋酸纤维素薄膜为支持物。二、材料和试剂 三、特点,特点：电泳后区带界限清晰；通电时间较短；它对各种蛋白质几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；灵敏度高，样品用量少。对染料也没有吸附。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果。,醋酸纤维素膜电泳槽,可做各种醋酸纤维素膜电泳、纸电泳及载玻片电泳等。,第四节凝胶电泳,琼脂糖、聚丙稀酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。琼脂糖凝胶电泳一般用低浓度的溴化乙锭染色，聚丙稀酰胺凝胶电泳一般用硝酸银染色，以确定DNA在凝胶中的位置。110ng的DNA就可以检测出。琼脂糖和聚丙稀酰胺凝胶可以制备成各种形状、大小和孔隙度，并在各种装置中进行电泳。聚丙稀酰胺凝胶的分辨率可以达到1bp。一般在垂直装置下使用。琼脂糖凝胶电泳的分辨率不如聚丙稀酰胺凝胶，但其分离范围较广。一般在水平装置下使用。,琼脂糖凝胶电泳主要用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。,影响琼脂糖凝胶在DNA迁移速率的因素,DNA分子的大小琼脂糖的浓度DNA的构象所加电压电场方向碱基组成与温度嵌入染料的存在电泳缓冲液的成分,DNA分子大小与琼脂糖浓度的关系,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,共价闭环cccDNA直线DNA开环的双链环状DNA,琼脂糖凝胶电泳的基本操作,、配制缓冲液贮备液、水平型琼脂糖凝胶制备、样品的制备与点样、电泳、染色、样品回收,桥式水平电泳槽,用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及分子量测定,DNA回收电泳槽,用于电洗脱回收DNA,微型水平电泳槽,用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及分子量测定,1 kb DNA ladder,An agarose gel with a 1 kb ladder,far right,Gel Electrophoresis,Gel Electrophoresis,Gel Electrophoresis,Small,Large,第五节 聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法 PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等,丙烯酰胺凝胶有以下优点：,几乎无电渗作用。化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度变化较稳定。在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好，易观察。凝胶孔径可调。分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。,一、丙烯酰胺凝胶聚合原理,催化剂和加速剂的种类,（1）AP-TEMED：化学聚合作用。加速剂TEMED的碱基可使催化剂过硫酸铵（简称AP）的水溶液产生出游离氧原子，然后激活Acr单体，形成单体长链，在交联剂Bis作用下聚合成凝胶。（2）核黄素-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。,二、凝胶组成成分的化学、物理性质,丙烯酰胺会产生如下几个化学反应：,高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸和NH3。与一些羟基化合物如酚或酯族醇反应，生成-芳氧基或烷氧基丙酰胺。在20能NH3反应，生成、-氮川三丙酰胺。与一些硫醇反应，生成-烷基丙酰胺。也会由于超声、-射线和自然光线引起聚合作用。如果烃键靠近在高度聚合的位置，酰胺基也会受到分子间的缩聚作用而成亚胺桥。,三、凝胶的孔径可调性及其他性质,每100亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，用T%表达；T%=(a+b)/ma：丙烯酰胺克数；b：N,N-甲叉双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）。,凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示。C%=b/（a+b）交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。分子筛效应标准凝胶,四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用,聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，可分为连续的和不连续的两类。前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。,在不连续PAGE系统里，存在三种物理效应,，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。、电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定速度泳动。、分子筛效应：区别不同大小分子种类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小的能力即分子筛效应。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。,、浓缩效应,六、SDS-PAGE 电泳原理,分子筛效应:分子大小和形状电荷效应：大部分的蛋白质在pH8.3电泳缓冲液的条件下带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢（强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散，并带上大量负电荷，导致本身电荷差别消失，因此SDS-PAGE分离蛋白主要依赖分子大小，而非电荷或形状）不连续系统具有对样品的浓缩效应,pH值的不连续 缓冲液离子成分的不连续 电位梯度的不连续 凝胶浓度的不连续以及电压的不连续.,SDS-PAGE电泳,浓缩胶的作用：浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而电泳液（pH8.3）中的甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是电导较低而电位梯度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移，样品夹在前导和尾随离子界面之间，使样品浓缩，并在分离胶前沿积聚。,分离胶的作用：分子筛和电荷效应 在pH8.8分离胶中，甘氨酸离子化，迁移率超过蛋白质，穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后泳动。SDS多肽复合物从电位梯度界面中解脱开来，在电位和pH值均匀的区段泳动，依MW大小得到分离。,分离胶(7-15%,pH8.8),浓缩胶(4-6%,pH6.8),加样,加电场，样品浓缩在界面上,电泳结束,+,封胶条,梳子,平，凹玻板,斜楔板,电泳槽,DYCZ-24D型垂直板电泳槽,聚丙烯酰胺凝胶的配制,贮液 分离胶（10%）浓缩胶（5%）ddH2O 3.3 ml 2.77 ml30%Acr/Bis 4.0 ml 0.83 ml1.5M Tris pH8.8 2.5 ml/0.5M Tris pH6.8/1.26 ml10%SDS 100 ml 50 ml10%APS 100 ml 50 mlTEMED 10 ml 10 mlTotal volume 10ml 5ml,20-37 30-45min,20-37 20-30min,按表中的顺序加入各溶液 每加入一种溶液，立刻混匀 TEMED加入之后聚合反应开始，应立即混匀并灌胶聚丙烯酰胺具有很强的神经毒性，应带手套操作！,配胶步骤,安装玻璃板并放置胶条,加少许水到凹槽内测试两层玻板间隙是否漏液,吸取少量水加到分离胶液面上,标记上下层胶的界面：梳子下0.5-1cm处,倾去覆盖液，用滤纸将残余液吸去，注意勿破坏凝胶面,配制浓缩胶溶液，加过TEMED后，立刻灌胶,室温放置30min,室温放置30-45min,取下玻璃板并抽出胶条,缓慢取出梳子,将电泳架放入电泳槽内，在内外槽 分别加入电泳缓冲液直至没过上样孔,上样：每个样品10ml，加入梳孔中,加上电泳槽盖，并连接电泳仪（注意正负极）,样品前沿（溴酚兰）进入分离胶后，调整电压为130V,溴酚兰抵达凝胶底部，关闭电源，并取出玻板,在玻板和凝胶间注入水，小心剥离凝胶，标记分离胶方向,考马斯亮蓝染色过夜、脱色2-3h，照相,在电压为80V的条件下开始电泳,电泳步骤,将带胶玻璃板再次固定到电泳架上（凹槽面朝内）,双垂直电泳槽,可用各种凝胶电泳，可同时做两块板,电泳印迹,电泳转移即电泳印迹。它是利用低电压，大电流的直流电场使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上。,电泳技术在农业中的应用,农业科研研究的对象是动物、植物和微生物。农业生产的产品也是动物、植物和微生物产品。在自然界中它们的种类有千千万万，它们的生殖和死亡、生长和发育、遗传和变异，以及新陈代谢的全部生命过程也是不同的。从DNA分子转如成RNA分子，由RNA分子再转译成多肽链，经过进一步切除、修饰、加工处理，卷曲构成蛋白质亚基。这些DNA、RNA和蛋白质分子不仅分子量不同，而且有不同的电荷效应，就可以通过电泳方法进行分离和研究。,电泳技术在农业科研中的应用,1、动植物分类及其种质资源研究2、基因分析3、遗传育种4、杂种优势理论5、雄性不育机制6、器官组织分化与生长发育中的基因调控,电泳技术在农业生产中的应用,1、种子纯度检验、农产品贮藏和加工的质量检验,等电聚焦示意图,电泳槽,适用于将凝胶电泳的图谱转移到固相转移膜上DF-9夹芯电泳槽 可做各种凝胶电泳,DF-13A转移电泳槽,转移电泳槽,单垂直电泳槽,可做各种凝胶电泳,双垂直电泳槽,可用各种凝胶电泳，可同时做两块板,新微型水平电泳槽,用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及分子量测定,板式序列宽槽,用于DNA序列分析,DNA回收电泳槽,用于电洗脱回收DNA,序列分析槽,用于DNA序列分析带冷却，温度可测,等电聚焦电泳槽,可做等电聚焦电泳及各种水平电泳 用于蛋白质、多肽、核酸、同功酶分析及鉴定,圆盘电泳槽,可做圆盘管式凝胶电泳,桥式水平电泳槽,用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及分子量测定,DF-C型定时双稳电泳仪,稳压：0-150-600V；稳流：0-25-100mA，定时：0-99h过载保护，两对输出插孔,DF-D型双稳电泳仪,高亮度数字表，电压、电流分别显示过载保护，两对输出孔，可做一般电泳,高压双稳电泳仪,0-400-1600V稳流：0-25-100mA，连续可调 可做序列分析电泳和一般电泳,高压三恒电泳仪,恒压：0-3000V；恒流：0-200mA；恒功率：0-60W可做聚焦、序列分析多种电泳,转移电泳仪,自动优先恒定控制：恒压及恒流，无需换档，操作简单同时显示电压、电流设定值（或输出值）具有设定参数与输出值显示自动切换功能具有高压输出启动确认及停电自动关断保护 最大输出：200V/1500mA/200W,毛细管电泳仪,凝胶真空干胶器,用于电泳后凝胶的干燥干燥时间：20-40min,凝胶成像分析系统,用于对各种凝胶和放射自显影胶片、印记杂交片的分析,