《电泳分离》PPT课件.ppt

1,第七节 电泳分离,电泳（electrophoresis,EP）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。,2,一、电泳的基本理论 1.原理:,在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状的带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。,3,迁移率与内在特性和外界条件有关内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性,带电粒子在单位时间内移动的距离称为电泳迁移率。移动速度(V)是电场(E)和迁移率(m)的乘积，即：VmE,4,影响迁移率的因素：1）颗粒性质：Q越大、r 越小、形状越接近球形，v 越快。2）电场强度：每厘米距离的电压差，E越高，v越快。常压电泳 E：210V/cm 电压：100500V，大分子物质分离 高压电泳 E：20200V/cm 电压 500V，小分子物质分离3）溶液性质：pH值：影响粒子所带净电荷量的多少，离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v 越低。通常，缓冲液离子强度在之间。4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。,5,自由界面电泳：又称移动界面电泳（moving boundary electrophoresis,MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:（zone electrophoresis,ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。,2.电泳的分类,6,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,7,琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，一般用于核酸的分离分析。（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应；（2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用；（3）无毒；（4）染色、脱色程序简单，背景色较低；（5）热可逆性；（6）生物中性：一般不与生物材料结合。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的两种支持介质。,8,3.电泳常用设备（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V50000V）（2）电泳槽：自由界面电泳槽 管状电泳槽 板状电泳槽（3）附属设备：外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却。灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子。,9,10,11,12,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。,13,1.原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。,14,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O C=O NH2 NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH NH2,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,15,16,（1）催化剂和加速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在4060分钟内完成。（2）系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。（3）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高温度可以使凝胶透明而有弹性。（4）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。（5）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合。,影响丙烯酰胺聚合的主要因素,17,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素光 催化剂:核黄素（维生素B2）引发剂:光 TEMED的存在，可加速聚合。,.,18,聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺N,N甲叉双丙烯酰胺聚合而成,19,凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。T=C=凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。Acr与Bis的质量比应在30左右。,凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,Acr（g）+Bis（g）,V（ml）,X100%,Acr（g）+Bis（g）,Bis（g）,X100%,20,聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表,21,2.分离效应 PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuous electrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuous electrophoresis）采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应不连续PAGE 分子筛效应 浓缩效应,连续PAGE,22,1）电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。,在直流电场作用下电泳情况示意图图中A，B，C均为阴离子分子量大小依次为MA=MBMC，所带电荷量相同QA=QB=QC。,23,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面：1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度。因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。,8.3,8.3,8.9,6.7,24,三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass,Mr）的一种最好的办法。,25,SDS-PAGE separates proteins by MW,26,1.原理：SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。,27,两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bmMW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,28,29,30,2.操作：（SDS-PAGE及PAGE，即变性及非变性）1）制胶:（变性：buffer 中加0.4%SDS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。,31,2）样品制备：a.PAGE:样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）b.SDS-PAGE:样品样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸25min，以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：SDS-PAGE:电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。,32,4）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7乙酸或12.5三氯乙 酸（TCA）中固定蛋白质组分。b.染色：考马斯亮蓝染色法 银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸Schiff试剂（糖蛋白）。,33,34,四、等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。,35,原理 两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。,36,优点：,分辨率高；电泳时间延长，区带越来越窄；样品可以加在电泳系统的任何部位；浓度很低的样品也可以进行分离；可用于准确测定蛋白质或其他两性电解质的等电点。,37,缺点：,电泳过程要求使用无盐溶液，可能会使某些在无盐溶液中溶解度较低的蛋白质产生沉淀；电泳后样品中各组分都聚焦到各自的等电点，对某些在等电点时溶解度较低或可能变性的组分不适用。,38,两性电解质载体(carrier ampholytes)(1)易溶于水，有足够的缓冲能力以便保 持稳定的pH梯度。(2)导电性能好以保持电场强度的均匀性。(3)分子量小电泳后易分离除去。(4)化学组成不同于蛋白质不干扰测定。(5)与样品中各组分不发生化学反应。,39,pH梯度的形成,两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面溶液的pH决定它带电荷的性质。如溶液是pH7，对pI=9的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对pI=3的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同pI的两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：使溶液pH有所改变。当某一两性电解质pI较低，即释放质子(H+)能力较强，使溶液pH值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，pI高的可使溶液pH值上升，称为碱性两性电解质。所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液pH值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境(水溶液)，使其pH值有所改变。,40,载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在311之间。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于pI的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时向负极泳动的速度也就因此不同。同理，负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。根据两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的pH。当达到平衡时，即得失质子相等，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的pI区域，pI即是指溶液的pH值。所以，溶液也因此呈现不同的pH，随载体两性电解质的pI梯度而形成pH梯度。,41,等电聚焦电泳,42,43,2.操作：1）凝胶 配制：凝胶浓度T为57.5（C=3%左右）2）加样：任意位置,44,3）电泳：要求开始电泳时恒压60V，15min，目的在于使小分子的，泳动快的载体两性电解质可在短时间内形成一个粗略的pH梯度。此后，恒流为8mA，是为了避免电泳开始时介质中带电颗粒较多，电泳电流过高而破坏凝胶。当各种蛋白质逐渐泳动到各自等电点位置时，带电颗粒逐渐减少，出现电阻增大，电压随之增高现象。当电压升到550V时，带电颗粒已大为减少，电流不再偏高，故恒压到580V，继续电泳120min后，蛋白质颗粒慢慢地集中到它等电点位置。电流接近于零时，蛋白质颗粒不再泳动，电泳也到此结束。4）固定及染色：TCA固定，考马斯亮蓝染色。,45,5）等电点测定：Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知pI。,IEF-PAGE测定蛋白质pI,46,3.应用：蛋白质的分离纯化测等电点,47,第一相：等电聚焦第二相：SDSPAGE目的：为了获得更详细的蛋白质组分信息。目前已经广泛应用于蛋白质组研究中,双相电泳,48,49,（1）在没有电场时，载体两性电解质的pH值是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都荷电。（2）当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为0的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。（3）其次，一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到0才停止。同样的，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个pH梯度。,pH梯度的形成,