《生物技术原理》PPT课件.ppt

生物技术原理,Biotechnology principle,基因决定性状（1）,青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素,基因决定性状（2）,家蚕能够吐出蚕丝为人类利用,基因决定性状（3）,豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮,人工选择与自然选择,定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,经过多年的努力，人类最终创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。,生物工程或生物技术,生物工程，又称生物技术(biotechnology)，是一门迅速发展中的边缘学科，它以分子生物学、分子遗传学、微生物学、生物化学和细胞学的理论和技术为基础，结合化学工程、计算技术等现代工程技术，运用生物学的最新成就，定向地改造物种，再通过合适的生物反应器，对这类“工程菌”或“工程细胞株”进行大规模的培养，以生产大量有用的代谢产物或发挥它们独特生理功能的一门新兴技术。,Molecular Biology,生物机能,蛋白质,基因,生物化学,遗传学,分子生物学,生物工程可包括,基因工程细胞工程发酵工程酶工程生物反应器工程 等五个不同的层次。,微生物生物工程流程,常规菌（常规细胞株）改造物种(1)基因工程(2)细胞工程 工程菌（或工程细胞株）商品生产(3)发酵工程(4)酶工程(5)生物反应器工程 产品,100000 b.C.经验遗传,10000 b.C.生物技术,2000 a.d.分子生物学,2001 a.d,基因组学,TCACCATGCGTTTTAGAACAGGTACGGATCAAAAGTACCTAGG,结构基因组学 Structural genomics,转录组学 transcriptomics,蛋白质组学 Proteomics,功能组学 Functomics,变种组学 Morphomics,糖组学 glycomics?拼接组学 spliceomics代谢组学 metabolomics脂组学 lipidomics,结构基因组学,病毒,细菌,酵母,植物,动物类 种间多态 种内多态,基因序列的分析基因变异的分析基因演变的分析,基因工程,基因工程是一种DNA的体外重组技术，是根据人们的需要，在分子水平上用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再移入原体细胞，使转录翻译及复制，表达出供体基因原有的生物学特性。1973年，由美国斯坦福大学教授科恩(S.Cohen)和美国加州大学教授博伊尔(H.Boyer)带领各自的研究组几乎同时完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。,美国斯坦福大学教授科恩(Stanley.Cohen)质粒上携带的信息与细菌抗生素耐性之间的关系,美国加州大学教授博伊尔(Herb.Boyer)限制性内切酶 EcoRI,1968年伯耶开始研究大肠杆菌，并从中分离得到了一种限制性内切酶，根据命名原则称为EcoRI，该酶的性质深入研究发现其可以在特定位置将DNA切开，并且还可以获得具有粘性末端的DNA片段。Hedgpeth J,Goodman HM,Boyer HW.DNA nucleotide sequence restricted by the RI endonuclease.Proc Natl Acad Sci USA,1972,69(11):3448-3452,1973年，科恩从大肠杆菌里取出两种不同的质粒。它们各自具有一个抗菌素药基因，他把两个基因“裁剪”下来，再把这两个基因“拼接”在同一个质粒中。当这种新的“杂合质粒”进入大肠杆菌体内后，大肠杆菌就能抵抗两种药物，而且后代都具有双重抗药性。1974年，科恩和博伊尔又把金黄色葡萄球菌的质粒（上面具有抗青霉素的基因）和大肠杆菌的质粒“组装”成杂合质粒，送入大肠杆菌体内，使大肠杆菌获得了对青霉素的抗药性。即金黄色葡萄球菌质粒上的抗青霉素基因，由杂合质粒带到大杆菌体内，表明外来基因在大肠杆菌体内同样能表达。他们又将非洲爪蟾的DNA与大肠杆菌的质粒“拼接”，使大肠杆菌产生非洲爪蟾的核糖体核糖核酸（两栖动物的基因能在细菌里发挥作用，也能在细菌里不断复制，说明基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照人类的意愿去拼接基因，创造新的生物）。,1974年11月，他们向USPTO申请了专利，经过漫长的6年之后，于1980年12月2日获得批准。这是生物工程史上的第一个克隆专利。从批准该专利到该专利1997年12月2日失效的17年中，该专利一共许可了468家公司，两所大学共获得了许可费收入约2.55亿美元。这些许可费收入主要来自生物工程巨头：安进、礼莱和基因泰克。,1976年，与风险投资家罗伯特斯万森(Robert A.Swanson)共同创建基因泰克(Genentech)公司 1977年，Genentech公司成功实现了人类蛋白质生长 激素抑制素在大肠杆菌中的表达 1978年，生产出人胰岛素 1979年，生产出生长素 1980年，生产出干扰素 1980年，Genentech公司上市不到1个小时，股票就从每 股35美元 升高到88美元,博伊尔,1)理论上的三大发现：发现了生物的遗传物质是DNA发现了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机理发现了遗传信息的传递方式2)技术上的三大发明：限制性核酸内切酶和DNA连接酶基因工程的载体逆转录酶的发现,基因工程的原理,基因工程的理论基础,人类需要的基因产物,结 果,剪切拼接导入表达,基本过程,DNA分子水平,操作水平,基 因,操作对象,生物体外,操作环境,基因拼接技术或DNA重组技术,基因工程的别名,1)物质基础脱氧核苷酸2)结构基础规则的双螺旋结构3)传递与表达基础中心法则，共用一套遗传密码,克隆基因的方法,克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因：1.PCR或RT-PCR法2.从cDNA文库中分离基因3.转座子标签法4.从基因文库中分离基因5.人工合成法,1.聚合酶链式反应(PCR),PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术。,加入4种物质：(1)作为模板的DNA序列；(2)与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物(20个左右碱基的短DNA单链)；(3)TaqDNA聚合酶；(4)dNTP(dATP,dTTP,dGTP和dCTP)。,聚合酶链式反应(PCR),变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,聚合酶链式反应(PCR),每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得 230(1.07109)个基因片段,2.cDNA文库的构建,cDNA文库：生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但由于细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因此由mRNA逆转录所构建的cDNA文库的库容量较基因文库小。,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题 费时费事 内含子序列,反转录人工合成互补DNA方法的优势 获取的DNA片段往往 具有特定功能的目的 基因,1970年特明(H.M.Temin)等在致癌RNA病毒（劳氏肉瘤病毒）中发现了一种特殊的DNA聚合酶，可以RNA为核板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase)。反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。,Howard Temin,反转录酶(reverse transcriptase),cDNA文库的构建,在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成,用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA,10_25_cDNA.jpg,Making cDNA from mRNA using reverse transcriptase and DNA polymerase,Amino Acid Codons,alanineGCA,GCC,GCGGCU,AGA,AGGarginineAGA,AGG,CGACGC,CGG,CGUasparagineAAC,AAUaspartateGAC,GAU cysteineUGC,UGUglutamateGAA,GAGglutamineCAA,CAGglycine GAA,GCC,GGGGGUhistidineCAC,CAUisoleucineAUA,AUC,AUUleucine CUA,CUC,CUGCUU,UUA,UUG,lysine AAA,AAGmethionine AUGphenylalanine UUC,UUUproline CCA,CCC CCG,CCUserine UCA,UCC UCG,UCU AGC,AGUthreonine ACA,ACC ACG,ACUtryptophan UGGtyrosine UCA,UCUvaline GUA,GUC GUG,GUU,3.转座子标签,转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得一恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。由转座子引起的突变便可以转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的DNA片段，并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。,麦克林托克(Barbara McClintock，1902-1992)1939年，曾为美国遗传学会主席1938年提出“转座基因”的概念1944年至1950年花了6年时间才得出结论 玉米籽粒（或叶片）颜色的有无是受一些位于9号染色体上的基因控制的，如控制色素形成的基因C。有C基因存在，籽粒（或叶片）有色，没有C基因，则表现无色。1951年，在冷泉港生物学专题讨论会上，递交论文,被遗传学界摒弃1983年获得诺贝尔生理和医学奖,转座子的发现,Transposition,first discovered by Barbara McClintock(Nobel prize,1983)when studying maize genetics,and is one of the processes by which organisms rearrange their genomes.,1951-Theory of controlling elements in maize1983 Nobel Prize in Physiology or Medicine,Barbara McClintock(19021992),激活因子(Activator),解离因子(Dissociator),斑点,无色,色素,1.自主性因子(antonomous elements)有切离和转座的能力。由于自主因子的持续活性，它们可以插入到任何位点产生一个不稳定的或可“突变”(mutable)等位基因。自主因子本身的丢失就使可变的等位基因变成稳定的等位基因。Ac2.非自主性因子(nonautonomous elements)是稳定的；它们自己并不能转座或自发地改变条件，当同一家族中的不稳定成员存在于基因组中时，不论这自主因子位于何处都能使非自主因子变得不稳定。Ds,转座子转移只发生在植物生长发育的某一特定时期,R Plasmids,耐药传递因子,耐药决定子,60年代中期，在细菌中发现了转化和转导现象；60年代后期，在细菌中发现了“转座子”；70年代，愈来愈多的“跳跃基因”被发现。这些因子不仅存在于细菌中，同时也存在于较高等的动物中。,R质粒就有一对插入序列(IS)，为典型的复合转座子,转座子的分类和结构特征,简单转座子 转座子(Transposon,Tn)是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列(Insertion Sequence,IS)，为细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。,插入序列：最小的转位因子，长度不超过2kb，不携带任何已知与插入功能无关的基因区域，往往是插入后与插入点附近的序列共同起作用，可能是原核细胞正常代谢的调节开关之一。,插入序列转位,转座酶基因,转座子,IS 1,IS 2,IS 4,IS 5,IS 10R,IS 50R,IS 903,IS序列的结构特征比较,长度(bp),两端倒置重复区(bp),靶位点正向重复区(bp),768,1327,1428,1195,1329,1531,随机,AAAN20TTT,有热点,有热点,有热点,NGCTAGCN,23,41,18,16,22,9,9,11或12,9,5,4,9,1057,18,9,未知,靶位点,转座子的分类和结构特征,复合式转座子(Composite Transposon)是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。,转座子转位,转座子：长度一般超过2kb，除携带与转位有关的基因外，还携带耐药性基因、抗金属基因、毒素基因及其他结构基因等。因此当Tn插入某一基因时，一方面可引起插入基因失活产生基因突变，另一方面可因带入耐药性基因而使细菌获得耐药性。转座子可能与细菌的多重耐药性有关。,转座酶基因,转座酶基因,耐药基因,Transposons,插入序列,转座子,转座子的特征,大肠埃希菌(肠毒素基因),Tn1681,Em,Tn971,Em(红霉素),Tn551,Tc(四环素),Tn10,Cm(氯霉素),Tn9,TMP(甲氧苄氨嘧啶)、SM,Tn7,Km,Tn6,Km(卡那霉素),Tn5,AP、SM(链霉素)、Su(磺胺),Tn4,AP(氨苄青霉素),Tn1 Tn2 Tn3,携带耐药或毒素基因,转座子,部分大肠杆菌复合转座子及其特性,转座子,Tn5,Tn9,Tn10,Tn204,Tn903,Tn1681,所携带的基因,总长度(bp),末端IS序列的长度 方向,抗卡那霉素,抗羧苄青霉素,抗四环霉素,抗氯霉素,抗卡那霉素,抗潮霉素,反向,反向,正向,正向,反向,反向,5700,2638,9300,2457,3100,2088,1500,1400,1050,768,768,768,转座子Tn3的结构,反向重复序列,反向重复序列,解离酶,转座酶,内酰胺酶,复合转座子Tn10的结构,反向重复序列,反向重复序列,酵母转座子Ty的结构,编码两个蛋白质,正向重复序列,正向重复序列,黑腹果蝇自主性P转座子的结构,反向重复序列,反向重复序列,Target DNA,transposase,Tn5,transposase,1,2,6,4,5,3,发卡结构,转座重组,根据转座中转座子复制与否，可分为两种：1.复制型转座：在转座过程中转座子被复制，1拷贝保留在原位点，1拷贝被转移到新位点。依赖于转座酶及解离酶。2.保守型转座：转座过程子转座子作为一个实体被转移到一个新位点。,复制型转座,保守型转座,转座子标签法,转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的微生物与某一污染物降解菌混合，因转座因子插入到某一降解基因的序列中而破坏了该基因编码的蛋白（酶），导致该菌的降解性能的改变或丧失，进而筛选出转座子插入突变株的方法。,降解菌,转座子(Tn5)突变,降解突变株的选择,从突变株中获得转座子(Tn5)及附近序列,从降解菌中筛选降解基因,在工程菌中表达,转座子标签法,分辨培养大肠杆菌S17-1（含Tn5 转座子）与降解菌按一定比例混合过滤，并将滤膜置于LB培养基培养6h用磷酸缓冲液将膜上的菌冲洗掉，稀释后涂布于选择培养基（含Amp及待降解物）中培养长出菌落即为Tn5插入变异株筛选抗药性基因，测定上、下游序列,转座子的遗传学效应,(1)引起插入突变。(2)插入位置上出现新的基因。(3)转座子是以它的一个复制品转移到另一位置，而在原来位置上保留原有的转座子。(4)改变染色体结构，主要导致染色体缺失、倒位等染色体畸变。(5)转座子可以从原来位置上消失，这一过程称为切离。准确的切离使因插入转座子而失活的基因发生回复突变，不准确的切离则不发生回复突变，而是带来染色体畸变。(6)调节基因活动的开关。(7)产生新的变异，有利于进化。,4.基因文库的构建,基因文库：生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息即全部DNA序列。,细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度,基因工程的操作步骤示意图,目的基因的蛋白产物容易鉴别目的DNA（或RNA）的纯度要高目的DNA（或RNA）片段的酶切产物大小合适,注意,