《生化实验》PPT课件.ppt

2012生化实验,实验安排,胰酶提取,第一天新鲜猪胰脏1个 冰浴下剥除脂肪和结缔组织粉碎胰脏 加100ml巳预冷却的乙酸酸化水溶液提取 检查提取液中PH，若高于pH3.0时应及时用10乙酸调节，使提取液维持在之间 在冷室5左右搅拌提取1824h,第2天4层纱布过滤，取滤液50m1pH2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1一2h)合并滤液，用乙酸溶液调正pH至 放置35h后，取上清，量其总体积盐析：加固体粉状硫酸铵，至40饱和度 盐析1hr 12000rpm 离心 10min 上清液加硫酸铵，至75饱和度 盐析1hr 12000rpm 离心 10min 沉淀 溶于10ml pH7.5,0.1 MTris 透析过夜，4 保存,卵清蛋白分离提取,第一天新鲜鸡蛋两只取蛋清50 ml温水浴2530加入等体积的三氯乙酸丙酮（1:2V/V）最终pH约3.5再继续搅拌30 min4放置过夜,第二天布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿色清液加入4预冷的丙酮200 ml在4放置2 h之后，弃上部丙酮液，下部沉淀部分于10000 rpm离心5 min收集沉淀沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜,第三天10000 rpm离心10 min,取上清液再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜第三天10000 rpm离心10 min,取上清液,亲和层析柱材制备,Sephadex-G75的活化及偶联 2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex G一75，溶胀洗涤数次 加入0.05M Nal04溶液50ml，30Min，蒸馏水洗涤数次，抽干备用 纯化的鸡卵粘蛋白35ml，加入活化葡聚糖凝胶 5K2C03、调pH7.59.0，缓慢搅拌3h，随时用5K2CO3保持pH的稳定 0.27gKBH4溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系，反应5h，pH维持在6.57.5 洗涤,基因组DNA提取,高温裂解（抑制DNase，促进其它分子变性，促溶）；试剂：NaCl,SDS,EDTA,Tris-HCl pH7.5；试验材料：微生物菌体；,检测：电 泳 0.50.6ARGAROSE；比 色 50ug/ml DNA;OD260/OD280=1.8，40 ug/ml RNA;OD260/OD2801.8,培养好的菌液1.5 mL，离心收集菌体600ul 65 预热的细胞裂解液，悬浮菌体加入60ul 酚滚动混匀，65，30min加入600ul氯仿混匀，静置45min，离心取上清,等体积氯仿抽提一次0.1V 3M NaAc（Ph5.2）、2V乙醇，7020 min沉淀DNA70酒精洗涤沉淀DNA，真空干燥沉淀溶于40-100L无菌水,质粒DNA提取,细菌质粒的提取细菌培养物的生长：选择压力LB培养基中生长到对数晚期细菌的收获和裂解：碱变性抽提的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。pH高达12.6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离,pH4.8的AC高盐缓冲液复性，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。,试剂：Solution 50mM 葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM EDTA(pH 8.0),高压灭菌，4保存：Solution II 0.2M NaOH,1%SDS,现配现用：Solution III 5M KAC 60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4保存,：3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，4保存,：氨苄青霉素 50mg/ml,：溶菌酶：酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)：异丙醇：LB培养基10:TE缓冲液 11:电泳试剂,含氨卞（100ug/ml）的LB培养基 培养菌体 37 200rpm 过夜吸取1.5ml,5000rpm,12min离心，取沉淀预冷的100ul Solution,充分振荡悬浮加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min,150ul预冷Solution III混匀,冰浴5min离心,12000rpm,5min取上清加等体积氯仿，静置2-4min，12000g 离心2-4min,取上清加2体积的乙醇,1/10体积乙酸钠，-80,5-10min 12000g 离心10min取沉淀 冷冻干燥悬于30ldd水1.2%Argose胶电泳鉴定,PPO提取、纯化,材料 马铃薯（大约每小组100-200g）,试剂：磷酸缓冲液A（0.03M,pH6.0,含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5甘油，1的聚乙烯吡咯烷酮）固体硫酸铵磷酸缓冲液B(0.03M,pH6.0,含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）,粗酶提取,土豆按1:1（W/V）比例与磷酸缓冲液匀浆2层纱布过滤滤液以6000rpm离心10min弃除沉淀获得酶提取液。,纯化I-盐析分级沉淀,酶粗提液中加固体硫酸铵到40饱和度6000rpm离心20min弃除沉淀上清液再加入固体硫酸铵达到70饱和度6000rpm离心20min，弃除上清液，得粗酶沉淀沉淀用10ml磷酸缓冲液B复溶,装入透析袋用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子得初步纯化PPO液,纯化II-分子筛凝胶层析,柱材处理 Sephadex G100干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀 24-48h，去掉悬浮的细微颗粒 凝胶液脱气体除,平衡0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）平衡，保持液面比胶面高1-2cm,装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通 将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部 凝胶沉积直到离层析柱上端1.52 cm处，保持液面比胶面高1-2cm，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上,纯化II-分子筛凝胶层析,样品处理：初步纯化PPO液留1ml，4 保存；余下样品反渗至2ml,测定考马斯亮蓝G250法测定蛋白质浓度 邻苯二酚测定PPO活性将有活性管合并得PPO纯化液IIPPO纯化液II留1/5-1/10体积，4 保存；余下样品留待上第二个柱,上柱 打开层析柱下端液体出口关闭下端液面出口 将2ml左右浓缩PPO初步纯化液缓慢加到胶面层析 打开下出液口，待液面比胶面高0.2cm左右，快速加洗涤液（平衡液），使液面比胶面约高1-2cm 调节流速，使进液速度与出液速度一致 每0.5ml收集1管，收集30ml,纯化III-离子交换层析,柱材处理 DEAE52干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡过夜，去掉悬浮的细微颗粒 0.5 N的HCL溶液中浸泡1-2 h，无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH 4以上 0.5 N的NaOH溶液中浸泡12 h，无离子水或蒸馏水将其洗至中性。,平衡0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）平衡，保持液面比胶面高1-2cm,装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通 将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部 凝胶沉积直到离层析柱上端1.52 cm处，保持液面比胶面高1-2cm，停止装柱,纯化III-离子交换层析,测定考马斯亮蓝G250法测定蛋白质浓度 邻苯二酚测定PPO活性将有活性管合并得PPO纯化液IIIPPO纯化液III4 保存,上柱 打开层析柱下端液体出口关闭下端液面出口 将2ml左右浓缩PPO纯化液II缓慢加到胶面层析 打开下出液口，待液面比胶面高0.2cm左右，加洗脱液进行梯度洗脱，调节流速，使进液速度与出液速度一致 每0.5ml收集1管，收集30ml洗脱液C1：50ml 0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱液C2:50ml 1M NaCL,蛋白质浓度测定（酶标板）,100ul考马斯亮蓝G250蛋白试剂 20-100ul样品液枪吸打，595nm测定,PPO活性测定（酶标板）,200ulpH5.8的0.2M磷酸二氢钠 0.1M柠檬酸缓冲液 2.5ul 0.05M邻苯二酚溶液枪吸打30 预热3-5min2.5-50ul 样品枪吸打410nm测定 0min,2min值,感受态细胞制备,感受态，就是细菌吸收转化因子（周围环境中的DNA分子）的生理状态 制备高效转化的感受态细胞的方法是：在冰浴中，用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚砜、二硫苏糖醇（DTT）或用氯化已胺钴处理制备感受态细胞。,感受态机理假说：局部原生质体化假说细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。酶受体假说感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。实验证据发芽的芽孢杆菌容易转化；E.coli 的原生质体不能被噬菌感染，却能受噬菌体DNA转化；dg不能转化，但完整的DNA可以转化，这可能是DNA能产生溶解细胞壁的酶；适量的溶菌酶能提高转化效率。蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；在细胞分裂过程中，一直都有原生质化产生，但感受态只在生长对数期的后期出现；现已分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受态细胞。,转化,细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一个细菌菌株的DNA，而导致外观形态特征和某些行为特征发生遗传性改变的生命过程。热激后，受体菌温浴目的，使其表达足够蛋白，以便能在含抗菌素的琼脂培养板上生长菌落。重组质粒DNA转化不同的受体菌，有着不同的转化效率。重组分子越大，转化效率越低。如果应用较大的基因片段制备基因文库，困难较多，成功率较低。在100ng/100l以下的DNA浓度范围内，转化效率与DNA分子数成正比关系。重组DNA分子没有甲基化选用限制系统即酶缺陷型菌株。防止重组DNA被菌体内酶降解,转化的是双链DNA，吸附在细胞表面的是双链DNA，但以单链DNA进入细胞。只有闭环DNA（CC）与开环DNA（OC）的转化，才能获得转化子，用线性质粒DNA（L）进行转化不能得到转化子DNA分子转化的复杂过程如下：吸附完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面。转入双链DNA分子解链。单链DNA进入受体菌，另一链降解。自稳外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。表达供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。,：大肠杆菌在LB平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基中摇瓶培养大肠杆菌到对数期(37 200RPM 3-4小时，如从冰箱中保存平板中挑取的菌落，则到对数期时间可能要到6-7小时)：取1ml培养物7000rpm,离心1min.收集菌体，冰浴放置：用预冷的氯化钙悬浮菌体，7000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置（可不离心，直接倒掉）：用预冷的氯化钙1ml悬浮菌体，冰浴，7000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置：加入200l预冷氯化钙，放置于冰浴，即得感受态细胞,此细胞可现用,也可在4保存1周，或分装于无菌离心管中,投入液氮,快速冷冻然后储于-70保存注意：在本操作流程的前几步中，每次离心后，应尽量将上清液去除干净，以防LB培养基的污染,现制感受态细胞可直接使用;b:冻存感受态细胞在手心缓慢融化.2:加入待转化外源DNA(40ng左右)，冰浴30min。3:42热冲击1分30秒4：冰浴5min5：加入1mlLB液体培养基，37保温45分钟1小时。6：取20200ul菌悬浮液，涂布于有选择压力的LB培养基上（本实验中为100ug/ml的安卞青霉素培养基），保温过夜。温浴后加菌液到培养基上同时加入4ulIPTG,20ulX-gal(如用兰白斑筛选）,转化效率每ugDNA经遗传转化所能形成菌落的总数。将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用LB稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。1000克隆X10ng/1 ng DNA（转化用）/ug=106cfu/ug氨苄青霉素抗性的转化体可将内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生 Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加倍，然后降低到初始水平 转化效率影响因素待转化DNA的浓度、纯度、构型感受态细胞 活细胞数不应超过108细胞ml 转化条件,