《生化实验2电泳》PPT课件.ppt
实验3血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳（Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）,遵义医学院生物化学教研室 朱 欣 婷,实验思路,蛋白质的理化性质有哪些？,蛋白质的分离方法有哪些？,本次实验利用了哪个性质？,生物化学教研室 朱欣婷,1.掌握电泳法分离蛋白质的原理；2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理和方法；3.进一步熟悉721型分光光度计的使用,生物化学教研室 朱欣婷,分离蛋白质的方法,分离方法,沉淀法,层析法,电学法,生物化学教研室 朱欣婷,（一）电 泳 技 术(electrophoresis),电泳：带电粒子在电场的作用下向着与其电性 相反的电极移动的现象。,电泳技术:指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。,生物化学教研室 朱欣婷,一、电泳的原理,以蛋白质为例：,H,OH,H,OH,pHpI pH=pI pHpI,生物化学教研室 朱欣婷,电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即,V粒子运动的速度 X电场强度Q粒子所带电荷 r粒子的半径介质的粘度,生物化学教研室 朱欣婷,二、影响电泳速度的因素,1.样品本身：,分子带电量：,分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦越小，u越大。球形分子 纤维状分子,分子大小：,生物化学教研室 朱欣婷,Q越多，u越大；,分子小，r越小，u越大；,2.缓冲溶液：,pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大,离子强度(I)：I越大，电动电势越小，u越小；I越小，电动电势越大，u越大，但样品易扩散。离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定,选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.020.2之间。,生物化学教研室 朱欣婷,电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。,3.电场强度(X),X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。,电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。,生物化学教研室 朱欣婷,4.支持介质：,目前常用的电泳支持物：纤维薄膜(玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜)凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶),生物化学教研室 朱欣婷,负极,正极,表面带负电荷,带正电荷的水层携带粒子向负极移动,如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。,电渗作用：,电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。,生物化学教研室 朱欣婷,以纸电泳为例:,（一）按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：1滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜)电泳2粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；3凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；4丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。,三、区带电泳的分类,生物化学教研室 朱欣婷,（二）按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：,1平板式电泳：支持物水平放置；,2垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；,3垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳,生物化学教研室 朱欣婷,(三)按pH 的连续性不同，区带电泳可分为：1连续pH 电泳：即整个电泳过程pH 保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2非连续pH 电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等。,生物化学教研室 朱欣婷,（二）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,生物化学教研室 朱欣婷,【实验原理】,1.血清中几种主要蛋白组分,缓冲液pH=8.6,pIpH,血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动,生物化学教研室 朱欣婷,血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的1、2、五个区带,请预测血清蛋白电泳区带图,清蛋白,1,2,生物化学教研室 朱欣婷,膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。,2.定量,生物化学教研室 朱欣婷,各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。,可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。,用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。,3.血清蛋白电泳结果的临床意义：,生物化学教研室 朱欣婷,临床上还可用A/G比来表示清球蛋白的量的关系：正常人A/G1.52.5,1准备与点样：,取两条2.58cm的膜条,充分浸透在巴比妥缓冲液中,取出膜条,滤纸吸去多余的缓冲液,无光面距一端1.5cm处作点样线,点样器下端粘上薄层血清,垂直点样,生物化学教研室 朱欣婷,放置膜条,平衡5分钟,通电,关闭电源,2电泳,点样面向下,点样端置于阴极,膜条贴紧滤纸，拉直膜条,电压：160v,时间：60 min,生物化学教研室 朱欣婷,通 电完 毕,浸于染色液（氨基黑10B）中,取出膜条,浸于漂洗液,3染色、脱色,取出膜条,5min,浸于漂洗液,2min,5min,浸于漂洗液,滤纸吸干薄膜,5min,直至漂净,生物化学教研室 朱欣婷,取试管6支编号16,.定量(两人的膜条共用),充分振荡脱净染料,比 色定 量,生物化学教研室 朱欣婷,1计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。清蛋白（2A/T）1001球蛋白（1/T）1002球蛋白（2/T）100球蛋白（/T）100球蛋白（/T）100,光密度总和T2A12,2计算出清蛋白与球蛋白之比值（2A/G）G=12,生物化学教研室 朱欣婷,1.点样面为不光滑面，勿用手触摸感知；2.点样量适中，垂直点样；3.点样端接电泳仪负极；4.膜条与滤纸需贴紧，拉直；5.谨防触电。,生物化学教研室 朱欣婷,1在本实验电泳过程中，正负电极各发生什么反应?电极附近的缓冲液有什么变化?2.电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？3.除利用电泳法分离蛋白质以外,还有哪些分离方法?4.简单绘制血清蛋白电泳后的谱图。5.电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在的原因。,思考与练习,生物化学教研室 朱欣婷,1.蛋白质的理化性质？2.蛋白质的盐析？3.蛋白质的显色反应有哪些？4.分离蛋白质的方法有哪些？5.层析技术的分类及各自的原理。6.透析的原理？,下次课预习内容,生物化学教研室 朱欣婷,
