《特殊萃取》PPT课件.ppt

6.1 基本知识,液液传质分离是利用溶质在两液相中不同的分配特性，通过相间传质达到分离的目的。,第六章特殊萃取,6.1.1 萃取剂的选择和萃取体系的分类,一、萃取剂的选择 一个合用的萃取剂应与原溶液形成不互溶的两液相，萃取剂还应具备以下性质：两液相容易分开，不形成乳化液；萃取剂与任何进料组分之间不形成共沸物；萃取剂对关键组分的选择性尽可能地高；萃取剂在萃余相中的溶解度应尽可能地低。,萃取剂的搜寻方法：(1)搜寻数据库。(2)主要筛选方法：a)选择同系物为萃取剂 b)罗宾斯表 c)氢键 d)极性作用 e)特定萃取剂的认定。,(1)简单分子萃取体系(2)中性络合体系(3)酸性络合萃取体系(4)离子缔合萃取体系(5)胺类萃取体系,二、萃取体系的分类,案例,伯、仲、叔胺分子中的氮原于具有孤对电子，能和无机酸的H+离子以稳定的配位键形成相应的铵盐。这些铵盐和季铵盐中的阴离子与水相中的金属络合阴离子发生交换，使被萃取物进入有机相。因此，这种萃取机理主要是阴离子交换反应。胺类萃取剂一般适用于无机酸、金属离子的萃取。另外，胺类萃取剂属于Lewis碱，利用它的弱碱特性，可实现对有机羧酸、酚类等的萃取分离。,6.2 溶剂萃取(Solvent extraction),溶剂萃取是利用液-液界面的平衡分配关系进行的分离操作。液液界面的面积越大，达到平衡的速度也就越快。因此要求两相的液滴应尽量细小化。平衡后，各自相的液滴还要集中起来再分成两相。通常溶剂萃取指物质由水相转入另一与水相不互溶的有机相后实现分离的方法。分离特点：简便、快速、应用广,溶剂萃取的基本原理,1.为什么溶质会转移？2.如何达到分配平衡？,静置分层,振荡萃取,含Ni2+水溶液（水相）氨性缓冲液（pH9）丁二酮肟萃取剂 加入CHCl3有机相,萃取过程,无机盐类溶于水，发生离解形成水合离子，它们易溶于水中，难溶于有机溶剂，物质的这种性质称为亲水性。离子化合物，极性化合物是亲水性物质。,物质的亲水性和疏水性,许多非极性有机化合物，如烷烃、油脂、萘、蒽等难溶于水，而易溶于有机溶剂，物质的这种性质称为疏水性（亲油性）。,萃取过程,萃取过程可以看作是被萃物M在水相和有机相中两个溶解过程之间的竞争。萃取过程为：S-S+2(M-Aq)Aq-Aq+2(M-S),有机物（包括一些在水中不离解的非极性的共价化合物）的萃取原理适用于“相似相溶原理”。从水溶液中将某些离子萃取到有机相，必须设法将离子的亲水性转化为疏水性。,中和电荷,引入疏水基,萃取剂-“运载工具”,丁二酮肟,亲水性水合阳离子中性疏水螯合物萃入有机相,8-羟基喹啉,+,萃取法基本参数,分配定律和分配比 分离系数 萃取率与萃取次数,分配系数和分配比,分配系数,例如，I2稀溶液在H2O/CCl4的分配,分配定律：在一定的温度下，当萃取分配过程达到平衡时，溶质在互不相溶的两相中的浓度比为一常数。即,例 含有I-的I2溶液在H2O/CCl4的分配，水溶液不仅有I2，还有I3-，这时分配系数并不是一个常数。,在实际工作中，人们所关注的是被萃物分配在两相中的实际总浓度各为多少，而不是它们的具体存在的型体。,即，在一定条件下，当达到萃取平衡时，被萃物质在有机相和在水相的总浓度之比。,分配比,分配系数和分配比的比较,分配比随着萃取条件变化而改变。因而改变萃取条件，可使分配比按照所需的方向改变，从而使萃取分离更加完全。,概念不同，关注的对象有差别两者有一定的联系,KD表示在特定的平衡条件下，被萃物在两相中的有效浓度（即分子形式一样）的比值；而D表示实际平衡条件下被萃物在两相中总浓度（即不管分子以什么形式存在）的比值。分配比随着萃取条件变化而改变。,分离系数：A/B=DA/DB“表示两种分离组分分离的可能性和效果”,问题：DA 和DB相差不太大，如何处理？,分配比可以衡量被萃物在一定条件下进入有机相的难易程度，但它不能直接表示出被萃物有多少量已被萃取出来。那么，如何表示萃取完全程度呢？,萃取率（Extractability/Percent Extration)）,同除cw Vo,相比R=Vw/Vo,当R=1时，,从萃取率公式可以得出如下几点结论：分配比越大，萃取率越高 有机相的体积越大，萃取率越大 萃取率与被萃物的含量大小无关，这就是所谓的“定量分离”,萃取率与萃取次数的关系多次萃取,设水相体积为V水（mL），水中含被萃物W0(g)，用V有(mL)萃取剂萃取一次，水相中剩余W1(g)被萃物，则,每次用V有 新鲜溶剂，连续萃取n次，则水相被萃物的剩余量为：,萃取进入有机相的被萃物总量为：,在实际工作中，对于分配比较小的萃取体系，可采用多次萃取操作技术提高萃取率，以满足定量分离的需要。萃取次数：,两种物质的分离,在实际工作中，萃取常用于两种或两种以上物质间的定量分离。决定两物质萃取分离效果的影响因子被定义为分离因子Kd：,A：易萃取组分B：难萃取组分,可见，分离因子和物质的分配比和浓度有关。但应指出，Kd只是提供A、B两种物质萃取分离难易的相对量度，而实际进行萃取分离的好坏与分配比的绝对大小有关。要实现A与B的一次萃取完全分离，应选择或控制萃取条件，使得DA102，DB10-2。,逆流型多级萃取方式,在萃取中，当lgKd不满足定量分离要求时，可采用逆流型多级萃取方式，经过若干级萃取后也可满足定量分离的要求。,Operation of extraction containers of Craig apparatus,Diagrammatic representation of distribution of solute in Craig extraction process,Distribution of solutes A and B in the Craig apparatus,例:8-羟基喹啉/氯仿萃取La3+,10mL氯仿一次萃取，E=95.6%10mL氯仿分二次萃取：第一次，E 1=91.5%第二次，E 2=99.3%可见，连续两次萃取提高了萃取率。,协同效应与协同萃取体系,在溶剂萃取过程中，用两种或两种以上萃取剂的混合物萃取某些金属离子时，其分配比（D协同）明显地大于在相同条件下单独使用每一种萃取剂时分配比之和（D1+D2）,即D协同（D1+D2）。这种现象称为协同效应。具有协同效应的萃取体系称为协同萃取体系。,例如，用HTTA-TBP-C6H6溶液从硝酸介质中萃取钇：,协同萃取中的第二萃取剂，通常采用活性溶剂或中性萃取剂。它们应具有如下特性：溶剂能取代已配位的水分子；溶剂本身具有一定的疏水性，但对金属离子的配位能力较有机螯合物弱；有利于满足金属配位数和配位体的几何因数,D分别1E4和1E6,协同萃取的应用 提高萃取的浓缩倍数 E=D/(DVw/Vorg)100%对于一般的萃取，通常Vw：Vorg不超过10，由于D的限制，一般只能浓缩10倍。而对于协同效应，由于D大大提高，可进一步提高相比。例如Cd()-H2dz-TOPO协同萃取，相比100：1时还可定量萃取。若结合反萃取，浓缩倍数可达1000。提高萃取比色的灵敏度 萃取剂本身是显色剂,通过形成三元络合物增大。例如Sn()与邻苯二酚紫(PV)形成二元络合物呈红色(555 nm，6.5104)，加入阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲胺(CTMAB)后形成三元络合物(662 nm，9.56104)，光谱红移，灵敏度增大。,洗涤、反萃取和解萃,洗涤：使杂质(含包藏水相)由有机相反萃到水相,而被萃物仍留在有机相。所以洗涤水相的条件选择应有利于杂质在水中的分配,如常在水中加入少量能与杂质元素络合的水溶性络合剂。反萃取：通过加入一种新的不含被萃物的水相,与萃取液接触,使被萃物返回水相的过程。反萃取技术通常是调节水相的酸度和络合剂、还原剂等组成,或者络合反萃、还原反萃、分步反萃等方法。可见,洗涤是一种特殊的反萃取。解萃:指把被萃物从有机相移出来的过程。除了反萃取外，还可采用蒸发方式除去有机溶剂。如醚的除去，可往有机相加入少量水，然后水浴加热除去醚。,乳浊液的形成及其消除在萃取过程中，由于剧烈振荡等原因，可能出现乳浊液现象，造成分层困难影响萃取效果。乳浊液是一种液体分散在另一种液体形成的亚稳态，与溶剂的特性，如表面张力有关。防止和消除乳浊液现象的主要措施有：避免过于激烈的振荡 加入中性盐 加入有机稀释剂，如少量乙醇或异丙醇 让乳浊液流过多孔物质 改成连续萃取,例：有机化合物的萃取,有机物的溶解规律:极性有机化合物，包括易形成氢键的化合物或盐类，通常溶于水而不溶于非极性或弱极性有机溶剂；非极性或弱极性有机化合物则不溶于水，但可溶于非极性和弱极性有机溶剂。,有机物萃取的溶剂选择:难溶于水的物质用石油醚等溶剂；较易溶者，用乙醚或苯萃取；易溶于水的物质用乙酸乙酯或其它类似溶剂萃取。,极性和非极性有机混合物 如丙醇和溴丙烷混合物，可加入水萃取丙醇；马来酸酐和马来酸混合物，可加入苯萃取马来酸酐。,极性相差不大的混合物 对于这类混合物，应选择合适的萃取条件，使混合物中某些组分与其它组分性质有较大的差别，同时选择合适的溶剂进行萃取。例如:,羧酸、酚、胺和酮混合物的分离 甲苯、苯胺和苯甲酸的分离,6.3 液固萃取-索氏(Soxhlet)萃取,液固萃取，又称浸取或提取，是一种分离和富集某些天然产物、生化试剂和添加剂的有效手段。由于溶剂渗入固体试样内部是比较缓慢的过程，因此液固萃取需要较长的时间，一般需要连续萃取。,索氏(Soxhlet)萃取器,萃取剂流向：Gas:C D E(gl)Liq.:A S(ex.)B C 新鲜溶剂循环萃取“静态”萃取,常将试样置于索氏萃取器中，用溶剂连续抽提，然后蒸出溶剂，便可达到含量较原试样增加上百倍的试液，有利于后续的测定。,应用 分析橡胶、塑料中添加剂。另外，一些天然化合物的提取也采用索氏萃取技术。例如：一种高效天然的甜味剂-甜菊叶中甜菊甙分析，是把甜菊叶粉末放在索氏萃取器内，用乙醇回流进行样品提取的。,6.4 微波萃取,微波加热特性：微波辐射能够穿透一些介质，直接把能量作用到反应物上使极性分子每秒产生25亿次以上的分子旋转和碰撞。能量传递方式与传统的传导加热方式不同，不仅加热速度快，而且可控能力强，从而量化地为反应提供精确的能量。,微波萃取是利用微波能强化溶剂萃取的效率，使固体或半固体试样中的某些有机成分与基体有效地分离，并能保持分析对象的原本化合物状态。特点：快速、节能、节省溶剂、污染小；有利于热不稳定物质，较少受被萃物极性的限制实验条件：萃取剂及用量，时间、温度和压力应用：提取土壤和沉积物中的多环芳烃等污染物；动植物中的天然产物,6.5 金属螯合物萃取,典型的金属螯合剂有Ox、H2Dz、DDTC、APDC等。螯合物萃取具有如下特点：金属螯合物通常具有较大的分配比金属螯合物在有机相的溶解度一般不大。可用于萃取分光光度测定,萃取平衡 金属螯合物萃取体系不单是螯合物在两相中的分离问题，而是牵涉到许多因素，如金属离子性质、螯合剂性质、溶剂性质、溶液酸度和其它络合剂等。现分别讨论如下：,萃取平衡关系图,1)萃取剂在两相中的分配 HR水HR有 2)（弱酸）萃取剂在水相中的电离 3)螯合反应 4)螯合物在两相中的分配,萃取反应为：当萃取反应达到平衡时，金属离子在两相中的分配比为：上式可进一步简化：,从分配比公式可以看出：分配比与被萃物的浓度Mn+无关，即不管其含量多少，萃取率都一样，符合定量分离的要求；决定螯合物萃取的分配比大小有许多因素，包括萃取剂的Ka,KD及其浓度以及水溶液的pH等；在同一萃取体系中，不同离子的分配比是水溶液pH和萃取剂浓度的函数。,影响金属螯合物萃取的因素,当 时，则有,在溶剂萃取中，pH1/2和萃取曲线是两个很重要的数据图表。,1）酸度,pH1/2,Zn范围,Hg完全萃取,萃取曲线的基本特征：沿横轴的pH值（曲线位置）取决于表观萃取常数的大小；曲线的斜率取决于金属离子的电荷数，n越大，曲线越陡，越有利于分离；可直观估计分离的可能性。,在实际工作中，pH1/2常用来表示某一萃取体系中，不同金属离子的萃取能力。,pH1/2也可代表金属离子的萃取特性，pH1/2越小，该离子越容易萃取。,2)有机试剂浓度,3)络合剂浓度,4)有机试剂的性质,5)溶剂性质,6.6 缔合物萃取,缔合物萃取又称离子对萃取。如某些金属以络阴离子或络阳离子形成离子缔合物的形式被萃取。,阳离子和阴离子通过静电引力相结合而形成的电中性化合物称为离子缔合物。如果该缔合物具有较大的疏水性，那么它易溶于有机溶剂而被萃取。即，,离子对的形成符合最小电荷密度原理。（参见胡之德,关祖京,分析化学中的溶剂萃取 P162),通常离子缔合物的萃取是选择或创造条件成为具有单电荷的而且是大的阴阳离子对。,缔合物萃取类型,金属络阴离子的萃取 碱性染料类 高分子胺类 溶剂化萃取体系 酸的萃取 用醚类萃取金属离子 用TBP萃取金属离子 金属阳离子的离子缔合体系 冠醚对金属离子的萃取,例1：金属络阴离子的萃取,萃取原理：金属离子与溶液中憎水性较大的简单配位阴离子形成络阴离子萃取剂中具有孤电子对的原子与溶液中H+的离子形成阳离子阴阳离子靠静电引力形成具有疏水性的离子对并萃入有机相,例2：碱性染料离子缔合物萃取,碱性染料化合物在酸性条件下形成大阳离子，利用它们与样品阴离子缔合成中性分子进行萃取。,碱性染料具有一个共同的特点，即其分子内吸电子基的氮原子上具有自由的未交换的电子对，可牢固地结合一个质子而发生离子化作用，中性染料分子转变成一价大阳离子。,三苯甲烷系碱性染料 罗丹明类染料,R1=N(CH3)2 N(CH2CH3)2,碱性染料阳离子可与一些金属卤素离子或硫氰酸根形成的络阴离子结合中性疏水缔合物而被苯、甲苯等惰性溶剂萃取。碱性染料离子缔合物萃取可用于微量金属元素的比色萃取分析。如次甲基蓝阳离子萃取BF4-：,主要萃取条件：配位阴离子、酸性溶液和惰性溶剂,例3：高分子量胺萃取,因此，高分子胺可用于水溶液中酸的萃取。,高分子量胺（本身是液体，有时溶在稀释剂中）与酸反应生成的盐难溶于水，但易溶于有机溶剂而被萃取。,溶于有机相中的高分子胺盐，与水相中的金属络阴离子接触时，发生交换过程，使水相中的金属络阴离子与有机相中的胺盐阳离子缔合生成三元络合物而进入有机相。其萃取过程为：,可见，这类反应具有溶剂萃取和离子交换两种作用，因此，这类胺盐也称为液体阴离子交换剂。它们还可以用碱溶液再生。,例4：溶剂化萃取体系,醇、醚或TBP（X酸三丁酯）类化合物碱性较强，特别适应于萃取强酸。如高氯酸、三氯乙酸、硝酸的萃取H(H2O)4+ClO4-+TBP(H2O)H(H2O)3 TBP+ClO4-+H2O,酸的萃取,例5：用醚类萃取金属离子-“羊盐萃取”,Al3+可以采用羊盐萃取吗？为什么？,羊盐（类似于“铵盐”）萃取的特点是分配比不一定大，但萃取容量较大，可用于萃取常量或大量的物质。如HCl 介质中乙醚萃取FeCl4-,萃取条件 使用含氧溶剂，其形成羊盐能力为：R2O ROH RCOOH RCOOR RCOR RCOH；采用高酸度，一般要求H+要达到（5-15）mol/L；被萃物酸根阴离子不能有大的亲水性；金属离子能与阴离子形成疏水性的配合阴离子。,例6:用TBP萃取金属离子 使用辛醇、TBP和氧化膦在高氯酸或硝酸溶液萃取金属离子。如在硝酸溶液中用TBP萃取金属离子：Mm+mNO3-+pTBP M(NO3)mpTBP,例7:冠醚萃取,适用于碱金属和碱土金属的萃取,冠醚结构：冠醚是一类大杂环化合物,杂环中包含着重复的-Y-CH2-CH2-环节。结构中-代表乙撑基-CH2-CH2-,它是冠状化合物的一个基本的结构单元,Y代表杂原子,可以是O、S、N、P等,分别称为氧、硫、氮、磷冠醚。,冠醚萃取原理：冠醚在一定的条件下能与离子形成有一定稳定性的主客体配合物。其主要作用力是离子-偶极静电作用,金属离子处在冠醚孔穴中间,可用于溶剂萃取、液膜分离和液相色谱等领域。冠醚络合物的萃取,类似于离子缔合物的萃取。金属离子先与冠醚形成金属离子冠醚配合物,然后与阴离子形成离子缔合物而被萃取。在通常情况下,碱金属是难于采用萃取分离的。冠醚主要用于碱金属和碱土金属的萃取,特别是它们对碱金属离子有较高的萃取选择性。但要注意冠醚的价格较贵,并且具有一定的毒性。,冠醚萃取金属离子的影响因素冠醚孔穴大小 冠醚环具有一定的揉曲性,外圈(乙撑基)疏水,内圈(杂原子)亲水。其孔穴大小与萃取选择性有关,应与金属离子的直径相匹配。如18-C-6的孔穴半径约2.63.2A,对K(离子半径为2.66A,而Na为1.9A)的具有较高的选择性。金属离子半径和电荷 主要考虑金属离子的半径和电荷,它们可能影响离子水化作用和对冠醚的静电作用。例如半径小,电荷多的Li、Ca2离子比Na更难萃取。Pb2和Sr2的离子半径相近,但Sr2具有惰性气体构型,其水合作用较强,因此DB-18-C-6对Pb2的萃取能力是Sr2的40-50倍。,溶剂化作用 常用极性不大的有机溶剂,如CHCl3、CH2Cl2。阴离子性能 阴离子的性质对冠醚配合物在有机相的溶解度有很大的影响。亲脂性、较软的大离子有利于萃取。应用举例 DCH-18-C-6（二环己基-)可用于从大量Ca2中萃取Sr2，Sr2的回收率达97%，而其中的Ca2仅存1/(104-105)。此法已用于牛奶中90Sr和89Sr的分析。,6.7 其它,（）共萃取与抑萃取共萃取是指某一元素(通常指微量元素)单独存在时不被萃取或很少被萃取，但与另一元素(提出是常量元素)存在时，则被萃取或萃取效率增大这一现象。这时的常量元素被称为共萃元素。在萃取分离中进行大量元素和痕量元素的分离时，应考虑共萃取现象可能引起痕量元素的损失或引入干扰。与共萃取正好相反，某一元素的存在降低了被萃元素的萃取率，称为抑萃取。,（）交换萃取,根据萃取常数的不同，利用金属配合物或其盐作萃取剂，发生金属或配体之间的取代反应，从而提高反应的选择性。金属离子间的交换萃取：如用铜铁试剂萃取金属离子时萃取常数顺序：Mo(）、Fe（）、Ga（）、Cu（）、In（）、Al（），如果用铜铁试剂的铜盐作萃取剂，则In（）和Al（）不被萃取，而Mo(）、Fe（）、Ga（）可取代Cu（）进入有机相。配体之间的交换萃取：如测定痕量锑时，先用苯萃取结晶紫和氯锑酸缔合物，然后用罗丹明6G交换缔合物中的结晶紫。,（）萃取色谱,萃取色谱是将溶剂萃取的选择性和色谱分离的高效能相结合的一种富集分离技术。如无机萃取色谱是将有机萃取剂或络合剂等吸附在惰性载体上，以无机物质如酸、碱、盐等溶液为流动相，用于分离无机物质的一种色谱法。如把TBP涂在硅胶柱上，以HNO3-H2O作流动相分离Zr和Nb。萃取色谱有两种形式：表面涂敷固定相和萃淋树脂(将萃取剂键合到惰性支撑体上)。,（）反胶团萃取,反胶团的特性 反胶团是表面活性剂在非极性有机相中的浓度超过临界胶团浓度时，它会形成一种纳米尺度的聚集体。,反胶团萃取机理,萃取过程中，水相中的溶质进入反胶团相需经历三步传质过程：通过表面液膜扩散，从水相到达相界面；在相界面处溶质进入反胶团；含溶质的反胶团扩散进入有机相。反萃操作中溶质亦经历相似的过程，只是方向相反，在界面处溶质从反胶团释放出来。,反胶团萃取机理,萃取过程反萃过程,反胶团萃取蛋白质的主要影响因素,反胶团萃取的应用,（1）分离蛋白质混合物；（2）浓缩-淀粉酶；（3）从发酵液中提取胞外酶；（4）直接提取胞内酶；（5）用于蛋白质复性。,案例,通过调节水相pH值和KCl浓度来实现三种蛋白质的分离。在pH=9时，核糖核酸酶的溶解度很小，保留在水相而与其他两种蛋白质分离；相分离后得到的反胶团相（含细胞色素C和溶菌酶）与0.5 mol/dm3的KCl水溶液接触后，细胞色素C被反萃取到水相，而溶菌酶留在反胶团相；含溶菌酶的反胶团与2.0 mol/dm3KCl，pH值为11.5的水相接触后，将溶菌酶反萃至水相中。,双水相萃取（aqueous two-phase extraction）是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来实现分离的一新型分离技术。由于它具有收率高、成本低、可连续化操作等技术优势，因而已被广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域，进行生物转化，蛋白质、核酸等产品的分离纯化。用此方法提纯的酶已达数十种，其分离也达到了相当规模。近年来又进行了双水相萃取氨基酸类和病毒小分子物质的研究，大大扩展了应用范畴并提高了选择性，使双水相萃取技术具有更大的潜力和美好的发展前景。,（）双水相萃取,双水相体系,图中把均相区与两相区分开的曲线，称为双节点曲线。如果体系总组成位于双节点曲线下方的区域，两高聚物均匀溶于水中而不分相。如果体系总组成位于双节点曲线上方的区域，体系就会形成两相。上相富集了高聚物Q，下相富集了高聚物P。用A点代表体系总组成，B点和C点分别代表互相平衡的上相和下相组成，称为节点。A、B、C三点在一条直线上，称为系线。,双水相中溶质分配理论,溶质在双水相中的分配性质可用分配系数K表示，计算方法如下：,溶质在双水相中的分配受表面自由能、表面电荷、疏水作用及生物亲和作用等因素的影响，其中表面自由能、表面电荷对分配行为的影响最为重要，因而对这两方面的理论研究也比较深入。溶质分配的理论研究对双水相萃取起到指导作用，使萃取过程可通过控制相关的影响因素而得到优化。,A 表面自由能的影响,因为大分子物质的Mr很大，的微小改变会引起分配系数K发生很大的改变，因此利用不同的表面性质，可以达到分离大分子的目的。,B 表面电荷的影响,C 疏水作用,两相系统中如有盐存在，会对大分子在两相间的分配系数发生改变,在pH值为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面疏水性的差异产生各自的分配平衡。,双水相萃取的应用,产品的浓缩蛋白质的提取和纯化生物小分子的分离和纯化中草药有效成分的提取生物活性物质的分析检测,案例,从细胞浆液中提取蛋白质时，蛋白质均分配于上相，而细胞或细胞碎片分配于下相。在大多数情况下分配系数大于3，很多杂蛋白也和细胞同时除去。实际操作中多数采用PEG盐体系，主要是因为这种体系物理特性较好易于相分离，而且价格也低。细胞浆液的加入量是一个重要参数。大量细胞或细胞碎片的存在使体系两相的粘度，特别是下相的粘度大大增高，上、下相体积比降低从而影响蛋白质的收率。根据经验，一般1kg萃取体系中加入200400g湿细胞为宜。从细胞浆液中提取到的蛋白质还需要进一步纯化。通常可通过多步双水相萃取来达到纯化的目的。第一步萃取后，分布于上相的蛋白质可通过加入适量的盐(有时也可同时加入少量的PEG)进行第二次萃取。通常第二次萃取的目的是除去核酸和多糖，它们的亲水性强，因而易分配于盐相中，而蛋白质留在PEG相中。第三步萃取的目的是使目的蛋白分配于盐相，使其与PEG分离，以便进一步纯化蛋白和回收PEG并循环使用。,