《流式细胞术培训》PPT课件.ppt

流式细胞术培训讲座,生物物理所蛋白质功能研究平台流式组,1980.1以前：1421980.11990.1:94501990.12000.1:33459.2000.12005.1:288502005.12009.4.15:29495,科技文献数量增长的一个简单统计,美国国立生物技术信息中心 http:/PUBMED 查询：检索关键词：flow cytometry 结果：,目录,（一）.流式细胞术的功能特点与应用 一.流式细胞仪的功能特点 二.流式细胞术的应用（二）.流式细胞仪原理简要 一.流体动力学聚焦 二.荧光光信号检测 三.细胞分选 四.实例及数据分析（三）.制备和设计流式样本 一.样本制备和实验流程 二.设计荧光染料组合的几个注意事项（四）.流式细胞术的新发展,流式细胞术的功能特点与应用,（1）流式细胞仪的定义 流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次通过探测光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，然后对信号进行处理，并能对多个参数进行关联分析的一种仪器。,一.流式细胞仪的功能特点,（2）流式细胞仪与荧光显微镜类比,一.流式细胞仪的功能特点,多通道（多参数）高通量高灵敏度定量高精确度细胞分选,（3）流式细胞仪的功能特点,（1）几个著名的实际应用：HIV感染与病程动态监测：辅助T淋巴细胞的绝对计数；癌症动态及治疗方案：细胞DNA含量和增殖活性；器官移植：交叉配型；分选人类染色体，建立遗传文库（genetic libraries）；动物育种的性别选择：分选含x或y染色体的精子；人类体外受精；造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别；海洋、环境微生物研究，发现未知种属。,二.流式细胞术的应用,当前流式细胞仪可测量颗粒大小最小约0.2m,（2）测量对象：颗粒尺度（单细胞悬浮液）,（3）可测量的细胞参数,细胞膜：表面糖分子、细胞膜流动性和通透性、膜融合和翻转、膜脂质构成、细胞膜及线粒体膜电位等。,细胞质：（1）Ca2+、Na+、K+、H+（2）信号网络蛋白、各种抗原、各类酶分子、细胞骨架蛋白、荧光蛋白（3）酶活、蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化修饰等,、,核酸分析：DNA、RNA含量，DNA合成、降解、断裂，区分核酸单、双链，测量端粒长度、染色质结构、碱基构成。染色单体分选。,无需染色：大小，颗粒度，自发荧光，色素，绝对计数等,经验性总结：细胞内几乎所有能够被荧光染料标记的成分或某种变化都可以用流式细胞仪进行检测。,流式细胞仪原理简要,一.流体动力学聚焦,流动室,流体动力学聚焦,流速：10m/s最大40m/s高通量20,000200,000 cell/S,激光聚焦,流体动力学聚焦的效果是，位于液流轴线上的细胞被依次排列成一条单细胞的队列，沿着一条极为精确而稳定的轨道运动。,二.荧光检测,探测光路聚焦,（1）空间立体激发结构,三轴垂直：高精确度2%的荧光差别,（2）散射光信号的产生,前向散射光：大小侧向散射光：颗粒度,面积（A）：荧光总量高度（H）：最大荧光强度宽度（W）：细胞直径,（3）PMT：光信号到电脉冲信号,（4）光学镜片,（5）各色荧光信号分离,多通道（多参数）,另一个参数：时间连续过程的检测,八角反射式信号收集系统,（6）更先进的光信号收集和分离方式,提高的灵敏度(二色反光镜)反射透射:95%80%,二.细胞分选原理,高通量高纯度：可达99.9%可分选极少含量的细胞多种分选方式,FACSVantage Diva的模拟四路分选。,四.实例与数据分析,（1）红细胞裂解后的外周血细胞检测,成分：样本中的细胞有单核细胞，淋巴细胞，粒细胞染色：单克隆抗体标记 1）CD14存在于单核细胞表面。荧光染料：Phycoerythrin（PE）2）CD45以不同的密度存在于所有白细胞表面。（淋巴细胞单核细胞粒细胞）荧光染料：fluorescein isothiocyanate(FITC).信号收集：FSC，SSC，PE/FITC双荧光信号。细胞数：10，000。,二维图：散点图,CD45 FITC(log)R1=单核细胞(CD14+ve)R2=淋巴细胞(CD45单核细胞)R3=粒细胞(CD45单核细胞),CD14 PE(log),CD14 PE,CD45 FITC,细胞数,细胞数,CD45 FITC,CD14 PE,一维图：直方图对比：双参数的二维图能提供更多信息,（2）DNA含量检测,BD FASCalibur,质量控制：变异系数（CV）：流式细胞仪的“分辨率”。,Tip：获取高质量数据的关键在于获得小的CV值。,（3）用流式细胞仪发现的侧群细胞（SP Cell）,(4)染色体核型,制备和设计流式样本,制取单细胞悬浮液,荧光染色,上机检测,数据分析,机械破碎，酶解消化，化学解聚去除碎步与团块,细胞吸收的荧光染料与其目标分子含量成正比，荧光信号强度与吸收的荧光染料分子成正比,仪器校准和优化,结合生理现象分析数据,实验流程,荧光染色设计的几个原则,了解仪器的激光/滤光片的组合匹配荧光亮度与最低密度的目标分子了解所用荧光染料的激发和发射谱减小荧光光谱重叠使用多杆激光，但需避免多重激发小心使用组合染料（tandem dyes）设定合适的对照样本（调节荧光补偿的样本）,（1）荧光补偿,发射光谱重叠带来干扰，需要将其进行补偿,Jerry Barnhart,CD45 FITC信号“渗漏”到PE探测通道，CD4 PE信号微弱的细胞不能被区分出来,CD45PercP信号不“渗漏”到PE探测通道，CD4 PE信号微弱的细胞被识别出来。,Jerry Barnhart,（2）了解染料光谱，合理选择组合多种荧光,（3）选择多杆激光，但注意避免双重激发,561nm激发光可更好的激发PE，但不能激发FITC，因此可避免荧光补偿。,Jerry Barnhart,CD19 FITC,22.5小时,AmCyan+,AmCyan-,多重激发导致荧光信号“渗漏”，降低分辨力,AmCyan：紫光及蓝光激发FITC：蓝光激发,Jerry Barnhart,（4）使用组合染料需考虑其技术限制,PE,CD8 PE-Cy7,CD3 PE-Cy5,0小时,2小时,22.5小时,(Alan Stall&Ken Davis),不稳定性,假阳性影响,-APC-CY7+PE-Cy7,+APC-CY7-PE-Cy7,（Jerry Barnhart）,+APC-CY7+PE-Cy7,流式细胞术的新进展,一.流式细胞术法发展状况,仪器技术：90年代后期，现在已相对成熟；试剂，染料：取得很大进展，目前类型已非常丰富，但商业化普及有所不足；数据分析技术：远滞后于前两者，可能成为将来流式技术最大的进步。,二.新应用,数据分析技术：高内容的多参数空间要求更有效的聚类算法；k-均值聚类-混合高斯模型特异性磷酸化蛋白多色检测试剂。胞内及表面染色：如MAPK，JNK，Erk，JAK/Stat等 信号通路动力学，测绘信号网络；基本机制研究；相关疾病诊断与治疗。,在当今系统生物学时代，了解蛋白相互作用的网络，多参数流式细胞仪可成为一种关键性的工具。,多参数流式细胞术改变了对抗原特异性T细胞反应的认识。多维的免疫关联性只能由多参数流式细胞术揭示。量子点染料技术得到大量应用。量子点染料与传统抗体交联：高亮，发射峰狭窄，更好的染色分辨率，更大的实验设计空间。Beckman-Coulter的新流式细胞仪-2009年下半年。,谢 谢,BD FACSCalibur,BD FACSAria II,BD FACSVantage Diva,BeckMan-Coulter MoFlo XDP,BeckMan-Coulter MoFlo XDP,BD Influx-7激光高速分选,声学耦合喷嘴,二维位置分选,光谱扫描,Moflo Astrios-7激光49色通道,Quick ReleaseNozzle,Sort Chamber,Electronics,Precision Optical Device(POD),Laser Engines,Pressure Console,Modular Laser Palette,355 nm True UV(100 mW),Up to 6 fiber coupled lasers+1 free-space UV,355 nm True UV(100 mW),640 nm(60 mW),592 nm(200 mW),561 nm(200 mW),532 nm(150 mW),488 nm(100 mW),405 nm(50 mW),Dr.Ger van den Engh Moflo&Influx之父,