肾上腺受体的分子药理学.ppt
肾上腺受体的分子药理学,第一节 肾上腺素受体的分型,分型的标准：对特异性配体(包括拮抗剂与激动剂)的亲和性 激动后信号传导机制及生物学效应的特点 基因的结构以及在染色体上的位置,表1-1 1-AR，2-AR与-AR的药理与信号传导系统特征,1-AR的亚型,Morrow与Greese于1986年用3H-哌唑嗪作为放射性配体显示拮抗剂WB4101及酚妥拉明与大鼠脑皮层中的1-AR有高、低亲和性两种结合位点，假设它们为1-AR的2种亚型，并分别称之为1A与1B亚型。此后很快得到全面证实,1A与1B亚型受体的药理特性及信号传导系统的主要差别,与氯乙基可乐定(CEC)的反应：仅1B-AR与CEC发生烷化反应从而被不可逆阻断 与选择性拮抗剂及激动剂的亲和性：与多数拮抗剂如WB4l01、酚妥拉明等及激动剂甲氧明、部分激动剂羟甲唑啉等的亲和性1A-AR显著高于1B-AR，仅对拮抗剂Spiperone的亲和性为1B-AR高于1A-AR信号传导机制：1A-AR激动后引起的生物学效应依赖于细胞外Ca2+的存在，而1B-AR不依赖。2种亚型受体激动时生成磷酸肌醇的种类、生成途径与时相等都有明显差别。,关于1c-AR亚型,1990年Schwinn等从牛脑得到一种新的1-AR cDNA克隆，其中跨膜部位氨基酸序列有72与1B-AR相同。在COS7细胞表达后检查这种受体的药理特性，发现它与WB4101、酚妥拉明等的亲和性显著高于1B-AR，而与1A-AR相近，但却又能被CEC不可逆性阻断，因而既不同于1A-AR，又不同于1B-AR，他们称这种受体为1C亚型。,关于1c-AR亚型(cont),Faure等、Rokosh等、price等、Perez等陆续采用更为精确的RNase保护分析方法显示大鼠1C克隆受体在大鼠组织中的分布与1A亚型相同。Ford等与Blue等还显示大鼠1C克隆受体的药理特性与1A亚型相似。因此，国际药理联合会受体命名与药物分类委员会决定取消1C而将原来的改为1A,1D亚型 的发现,1991年 Perez等从大鼠脑海马回中克隆到一种1-AR cDNA，它的碱基对序列与Lomasney报道的克隆只差2个碱基对在COS7细胞表达后的药理学特性检查，发现它与WB4101及5-MU的亲和性虽略高于1B-AR，但又显著低于1A-AR对(+)niguldipine的亲和性甚至比1B亚型还低，而且可部分被CEC不可逆阻断。因而他们认为这是第四种1-AR亚型，称之为1D。,表1-2 1-AR三种亚型的主要区别,2-AR的亚型,根据对选择性拮抗剂的亲和性及组织分布特异性，可将2-AR分成2A、2B与2C 3种亚型 见表1-3 2-AR各种亚型的药理学特性,采用分子生物学技术的分型,最先分别从人血小板、基因库与肾脏克隆到3种2-AR，其基因分别位于第10、第2与第4对染色体上，故称作2-C10、2-C2与2-C4亚型2-C10的药理特性及分布与2A完全相符。关于2-C2、2-C10与2B、2C间的关系尚未完全定论，但多数意见认为2-C2与2B对应，2-C4与2C对应。,-AR的亚型,60年代中后期已确定-AR包含1与2亚型，与内源性激动剂的亲和性：1-AR为EPiNE，而在2-AR则EpiNE随后不久也发现脂肪组织中部分-AR的药理特性与l-AR、2-AR均不相同,-AR的亚型（cont）,1989年Emorine等采用火鸡1-AR与人2-AR基因的完整编码区筛选人基因文库，得到一种既不同于1-AR，又不同于2-AR的克隆基因其编码402个氨基酸，序列与人1-AR及2-AR分别仅有50.7和45.5相同(人1-AR与2-AR之间有48.9相同)，称之为3-AR。,3-AR与l-AR、2-AR的药理特性,将人3-AR基因与人l-AR、人3-AR cDNA分别在CHO细胞表达后，观察与比较这三种-AR亚型的药理特性发现3-AR与l-AR、2-AR显著不同，而与以前报道的非典型-AR基本一致(见表1-4),第二节 肾上腺素受体结构与功能的关系,AR分子的基本结构,AR分子由429-561个氨基酸残基组成，有7个区域，为连续20-28个疏水氨基酸组成，形成7个跨膜片段构成3个细胞外环与3个细胞内环，受体分子的氨基端在胞外，羧基端在胞内。,AR结构示意图,研究AR结构与功能的方法,删除(deletion)法：即有目的地去除一段基因DNA，使表达的受体缺少一段氨基酸序列；点突变(site mutation)法：即有目的地改变基因DNA中的碱基对序列由别的氨基酸来代替；嵌合(Chimeric)法：即在两种亚型AR间交换某一区域结构，嵌合成一种新的包含两种亚型结构的受体。,细胞外区域的功能,糖基化位点：其相连的糖起什么作用至今不明，至少可以肯定它们与配体结合特性没有关系。细胞外环中的某些半胱氨酸可通过二硫键来稳定配体结合袋(Ligand-binding pocket)。用其他氨基酸取代其中一个半胱氨酸都能使受体配体结合能力降低,跨膜区域的功能,7个跨膜单位在膜上按一定位置构成配体结合袋。证据有3个方面：,采用放射性光亲和性探针与2-AR或2-AR共价结合，然后酶解AR蛋白质，显示探针与AR共价结合的部位都在跨膜区域,在2-AR删除亲水性细胞外环或细胞内环各区域片段，对配体结合特点并无影响，但当删除疏水性跨膜片段的氨基酸片段时，则见配体结合能力明显减弱。如改换2-AR第、第、第或第跨膜区中若干高度保守氨基酸中任意一个氨基酸，其配体结合性质也发生重大改变；,研究一系列1-2、2-2或2-1B等嵌合受体的药理特性，发现第与第跨膜区域对决定拮抗剂结合特性起关键作用，而所有至跨膜区域结构都与激动剂结合特性有关。,细胞内区域的功能,决定受体激动后与G蛋白耦联的结构则存在于细胞内区域：将2-AR第个跨膜区换成2-AR的结构，2-AR嵌合受体尽管在与配体结合特性上表现出2-AR的特性，但当2-AR部分激动剂P-aminoclonidine(PAC)作用于该受体时却表现出典型2-AR的效应，即腺苷酸环化酶活性增高，而不是2-AR激动时产生的腺苷酸环化酶活性降低。,AR的固有活性,野生型AR第3细胞内环的固有结构就具有与相应G蛋白结合进而起到信号转导与产生效应的功能但由于其羧基端某些关键氨基酸与受体其余部分结构的相互作用而限制了这一功能的表现当用突变手段替换这些关键氨基酸，或当激动剂与受体结合时，受体构型发生变化，这种限制作用撤销，故而第3细胞内环与G蛋白结合的固有活性得以表现出来，与此同时受体与激动剂的亲和性也显著提高。,例如：将2-AR第3细胞内环羧基端第266、第267、第269与第272位上的亮、赖、组、亮氨酸分别换成丝、精、赖、丙氨酸后，这一突变受体与拮抗剂的亲和性不变，但与激动剂的亲和性显著增高；在无激动剂存在下，腺苷酸环化酶的激活甚至可达到完全性激动剂作用于野生型2-AR时的水平,肾上腺素受体的信号传导机制,1-AR的信号传导途径,l-AR激动时通过与其耦联的G蛋白激活PLC，PLC催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)水解生成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)与二酰基甘油(DAG)，前者引起细胞内Ca2+释放，后者激活PKC，进而引起生物学效应,2-AR的信号传导途径,2-AR与Gi蛋白耦联，激动时使腺苷酸环化酶(AC)活性降低，cAMP生成减少，进而引起效应。,-AR的信号传导途径,所有3种-AR亚型都与Gs蛋白耦联，激动时使AC活性增强，cAMP生成增多，进而引起生物学效应,第四节 激动剂引起的肾上腺素受体减敏,受体-G蛋白脱耦联,受体特异性激酶引起的脱耦联与减敏:当激动剂与-AR结合并引起Gs蛋白激活时，Gs与G分离，游离的G蛋白与-ARK的羧基端结合，能使-ARK由胞浆转移到膜上并得到激活。激活的-ARK引起受体羧基端和第3细胞内环上的苏氨酸和丝氨酸磷酸化，磷酸化了的受体与-arrestin结合，从而使受体失去与G蛋白耦联的能力。,这种由-AR引起的减敏发生非常快，t1/2为15s左右，程度约占总减敏中的70左右。由于-ARK只能特异性地引起-AR磷酸化，因而引起的减敏为同源性减敏。,效应激酶引起的脱耦联与减敏:AR激动时最后通过蛋白激酶A(PKA)或PKC引起生物效应，而PKA或PKC本身又可使受体磷酸化，从而直接引起受体脱耦联与减敏。,这种减敏与-ARK引起的减敏有以下区别：产生速度相对较慢，t1/2约为2 min左右；产生减敏所需的激动剂浓度远较-ARK引起减敏时低(EC50分别为10 nmolL与300 nmol/L)，因而推测在低浓度激动剂存在时，仅这种机制引起减敏；产生异源性减敏。,受体扣押与内陷,扣押指受体在细胞膜上的位置发生变动而致使激动剂不能与其结合 内陷则是指受体离开细胞膜而移入细胞浆内,受体数量下调,受体下调可以由于受体降解增多增快，也可以由于受体生成减少减慢。,G蛋白功能降低或数量减少,激动剂持续性作用于AR时其相关G蛋白可能通过降解加速、与激动剂一起内陷、基因表达减少以及mRNA稳定性降低等途径而减少，受体功能下降。,第五节 各型AR之间的交互作用,-AR与2-AR之间的交互作用:例如Sakaue等在HT-29细胞显示-AR激动剂或cAMP衍生物能引起2A-AR基因转录速率增加，mRNA水平增高，2A-AR数量增多，2A-AR激动剂的效应增强。,思考题,对肾上腺素受体结构和功能的研究有哪些基本方法和过程?,
