《氨基酸工艺学》PPT课件.ppt

氨基酸工艺学,生命科学系,课程内容,绪论谷氨酸发酵其他氨基酸发酵,参考书,氨基酸工艺学 陈宁 中国轻工业出版社氨基酸发酵工艺学 张克旭 中国轻工业出版社味精工业手册（第二版）于信令 中国轻工业出版社,学习目的,以探讨氨基酸发酵工厂的生产技术为主要目的。氨基酸发酵生产以发酵为主,发酵的好坏是整个生产的关键,但后处理提纯操作和提纯设备选用当否,也会大大影响总的得率。氨基酸发酵工艺学研究的对象应该包括从投入原料到最终产品获得的整个过程,其中有微生物生化问题、生化工程问题,也有分析与设备问题。,绪论,第一节 概述氨基酸的种类（自学）氨基酸的性质（自学）氨基酸的生产方法 1.水解法 2.合成法 3.酶转化法 4.微生物发酵法,氨基酸发酵的特点氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵,由发酵所生成的产物氨基酸,都是微生物的中间代谢产物,它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。在脱氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改变、控制微生物的代谢,使有用产物大量生成、积累。代谢控制发酵（又称新型发酵）氨基酸发酵为好气性发酵 菌种：细菌,绪论,第二节 氨基酸发酵的历史与发展1820年有人在实验室水解蛋白制取氨基酸。1866年里豪森利用H2SO4从小麦面筋制取Glu。1908年从海带中提取了Glu，并制取了味之素。1910年日本人开始利用小麦面筋工业化制取味精。1923 年吴蕴初先生创办了上海天厨味精厂。1936年美国人开始从甜菜废液制取味精。1957年日本发酵法生产味精。,绪论,氨基酸发酵的现状 1.谷氨酸1964年发酵法生产味精才获得成功并在上海工业化生产。2006年我国味精总产量130多万吨，居世界首位。,绪论,绪论,绪论,绪论,2006年我国味精行业经济技术指标1）味精精制成本：山东齐鲁味精集团公司 5223.00元/t2）糖化收率：山东齐鲁味精集团公司 99.99%3）平均产酸：河南莲花味精集团 15.10%4）发酵转化率：山东齐鲁味精集团公司 65.70%5）提取收率：江苏菊花味精集团公司 99.90%6）精制收率：山东铃兰味精工业公司 99.10%,绪论,其他氨基酸,绪论,2.赖氨酸L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一,是世界上仅次于味精的第2大氨基酸品种。,绪论,绪论,3.苏氨酸截至2006年,全球饲料中苏氨酸的需求量每年约为11万t,中国的需求量约为2万t。目前,在苏氨酸领域研究开发处于世界领先水平的是日本味之素公司,它是全球最大的苏氨酸生产公司,总产能每年达到6.6万t,大约占全球市场份额60%。我国最大生产企业吉林大成集团，年产近万吨。,绪论,4.蛋氨酸到2010年,全世界蛋氨酸需求将达到90万t,中国的需求量也将超过10万t。近年中国对蛋氨酸的需求量还将持续增长,但一定时期内依靠大量进口来满足。中国是世界第2大饲料生产国,市场需求的年增长率7%8%,蛋氨酸基本依靠进口。,绪论,5.色氨酸色氨酸是重要的氨基酸之一,L-色氨酸为蛋氨酸、赖氨酸之后的第3饲用氨基酸,目前世界色氨酸年产约3000多t。我国尚不能大规模生产。,绪论,第三节 氨基酸的应用医药 Glu治疗肝昏迷。氨基酸大输液。食品 调味品 味精，稀释3000倍，鲜味，阈值0.03%。Gly：蔗糖的0.8倍。Asp-phe甲酯（阿斯巴甜），蔗糖的200倍。,提高食品营养价值，强化食品 评价蛋白质营养价值的指标，看食物中蛋白质的量（含量）和质（氨基酸之间的构成比例）。农业 饲料用Lys，添加0.2%，鸡每年生蛋250个，猪120天长只至180斤，鸡56天长3.5斤。工业 聚Glu，可降解塑料，环境友好材料。,绪论,采用诱变、细胞工程、基因工程的手段选育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种,提高产酸;采用过程控制,进行最优化控制,连续化、自动化,稳产、高产;探求新工艺、新设备,以提高产率和收得率;研究发酵机制等问题,以便能更好地控制氨基酸这样微生物中间代谢产物的发酵。,什么是味精？L-谷氨酸一钠一水化合物 HOOCCH2CH2CHCOONaH2O|NH2性状：无色柱状结晶或粉末。纯度：99%或80%,味精的安全性1987年联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂标准委员会就作出“食用安全，无须限量的规定”的科学论断。中国发酵工业协会曾于1993年组织“味精营养与安全研讨会”，多位专家在研讨会作了精彩的发言，肯定了味精的安全性。,味精厂的主要生产车间糖化车间发酵车间提取车间精制车间,第一章 淀粉水解糖的制备,第一节 淀粉的组成及其特性一、淀粉的性状及组成性状 白色无定形结晶粉末。形状为：圆形、椭圆形、多角形。,第一章 淀粉水解糖的制备,组成直链淀粉,第一章 淀粉水解糖的制备,支链淀粉,第一章 淀粉水解糖的制备,淀粉与碘的颜色反应,淀粉蓝糊精红糊精无色糊精葡萄糖蓝色紫 色红 色无 色酒精反应,第一章 淀粉水解糖的制备,淀粉的糊化 1.定义 淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性的淀粉糊。,第一章 淀粉水解糖的制备,2.过程第一阶段:淀粉缓慢地可逆地吸收水分,淀粉颗粒已有些微膨胀。第二阶段:当温度升到大约65 时,淀粉颗粒经过不可逆地突然很快地吸收大量水分后,膨胀粘度增加很大。第三阶段:当温度继续升高,淀粉颗粒变成无形空囊,可溶性淀粉浸出,成为半透明的均质胶体。,第一章 淀粉水解糖的制备,不同原料淀粉糊化温度,第一章 淀粉水解糖的制备,三、淀粉的生产原理 不溶于冷水，相对密度大于1。工艺（玉米淀粉）1.清理（除杂）目的：清除杂质,第一章 淀粉水解糖的制备,2.浸泡目的：（1）软化（2）溶解（3）除杂工艺条件 温度：50-55 时间：48h 二氧化硫0.15-0.2%,第一章 淀粉水解糖的制备,3.粗碎目的：粉碎成10块以上的小块4.胚芽分离目的：分离胚芽,第一章 淀粉水解糖的制备,5.磨碎目的：破坏细胞组织，释放淀粉。6.纤维分离采用筛选法分离。7.蛋白质分离原理：利用相对密度不同。8.清洗目的：去除可溶性杂质。,第一章 淀粉水解糖的制备,9.脱水采用离心机。10.干燥带式干燥机11.成品整理粉碎和筛分。,第一章 淀粉水解糖的制备,第二节 淀粉水解糖的制备方法一、意义和要求糖化：工业上将淀粉水解为葡萄糖的过程成为糖化。,第一章 淀粉水解糖的制备,第一章 淀粉水解糖的制备,第一章 淀粉水解糖的制备,谷氨酸发酵水解糖的要求1.严格控制原料质量2.正确控制淀粉乳的浓度3.水解完全4.糖液清、色泽浅5.糖液新鲜6.降低糖液蛋白质的含量,第一章 淀粉水解糖的制备,7.质量标准（1）色泽：浅黄、杏黄通明液体；（2）糊精反应：无；（3）还原糖含量：18%左右（4）DE值：90%以上；（5）透光率：60%以上（6）pH：,第一章 淀粉水解糖的制备,二、淀粉水解的方法与比较淀粉水解的方法 酸解法 酶酸法 酸酶法 双酶法,第一章 淀粉水解糖的制备,1.酸解法（1）工艺流程：淀粉、水、盐酸调浆进料水解冷却、中和脱色过滤糖化液（2.）工艺特点 高温、高压 糖化时间短 副产物多、糖化收率低,第一章 淀粉水解糖的制备,（3）水解工艺条件：a.淀粉乳的浓度控制在18-22%。b.盐酸的用量为干淀粉的0.6-0.7%，通常控制淀粉乳的pH值为1.5左右。c.进料压力。d.水解压力0.28-0.3 MPa。e.水解终点检查采用无水乙醇检查无白色反应为止。,第一章 淀粉水解糖的制备,（4）中和、脱色的工艺条件 淀粉水解后，在水解液中尚含有少量蛋白质等胶体物质，除去这些物质的方法：以Na2CO3调整水解液的pH值到这些杂质的等电点，约为，这个过程称为中和。中和的温度控制在70-80。,第一章 淀粉水解糖的制备,糖液的脱色一般采用粉末活性炭脱色，具体工艺条件如下：用量：为糖液的0.1-0.2%温度：65-80 时间：30min pH：,第一章 淀粉水解糖的制备,（5）过滤,第一章 淀粉水解糖的制备,过滤设备通常采用板框式过滤机。它的规格型号的表示方法如下：F B M(A)Y(S)/-其中：F表示防腐型 B表示板框压滤机 M(A)表示明流（暗流）Y(S)表示液压压紧（手动螺旋压紧）表示过滤面积 表示型号 表示框厚,第一章 淀粉水解糖的制备,第一章 淀粉水解糖的制备,第一章 淀粉水解糖的制备,2.酶酸法 原料粉碎调浆液化灭酶过滤调酸糖化中和脱色过滤糖化液-淀粉酶的用量：10-12u/干淀粉。,3.双酶法 原料粉碎调浆液化灭酶调整pH糖化灭酶中和过滤糖化液-淀粉酶的用量：10-12u/干淀粉。糖化酶的用量：100-120 u/干淀粉。,第一章 淀粉水解糖的制备,-淀粉酶（1）生产菌 枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉、拟内孢霉等等。（2）类型 常温和高温 固态粉末和液体（3）作用方式 可以切断-1，4糖苷键 不能切断-1，6糖苷键,第一章 淀粉水解糖的制备,（4）特性热稳定性 60 以下稳定作用温度 60-70；90-110pH稳定性 稳定，5.0以 下失活严重,糖化酶（1）生产菌 黑曲霉。（2）类型 固态粉末和液体（3）作用方式 可以从非还原性末端切断-1，4糖苷键；缓慢切断-1，6糖苷键,（4）特性作用温度 40-65；最佳58-60pH稳定性 稳定 最适,双酶法工艺特点1）副产物少，糖液纯度高；2）生产工艺条件温和；3）淀粉浓度高，可以使用粗原料；4）糖液质量高；5）周期长，设备多。,第三节 双酶法制糖工艺,发酵车间,调浆罐,液化罐,灭酶罐,糖化罐,板框过滤机,换热器,喷射液化器,一、淀粉的液化淀粉的糊化（参看淀粉的性质）液化的方法（1）间歇液化 85-90 保温30-60min。碘液检查合格（呈棕红色）。经常使用中温酶,（2）喷射液化,调浆,喷射液化（95-105）,保温液化,灭酶（120-145）,二、淀粉的糖化衡量糖化的经济技术指标1.理论收率（C6H10O5）n n H2On C6H12O6 162 18 180 理论收率111.11%,2.实际收率3.淀粉转化率,DE值与DX值1.DE值表示淀粉水解程度或糖化程度。也称葡萄糖值。,2.DX值糖液中葡萄糖含量占干物质的百分率。,糖化工艺条件 pH:4.20.1 温度：60 糖化时间：32-40小时 升温灭酶、中和：70-80 保温15min,第二章 谷氨酸发酵机制,第一节 谷氨酸的生物合成途径 主要包括EMP、HMP、TCA循环、乙醛酸循环、CO2固定反应。一、生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸脱氢酶(GHD)所催化的还原氨基化反应 转氨酶(AT)催化的转氨反应谷氨酸合成酶(GS)催化的合成反应,还原氨基化为主导性反应,二、谷氨酸生物合成的理想途径,C6H12O6+NH3+1.5O2 C6H9O4N+CO2+3H2O,三、谷氨酸发酵的代谢途径,控制谷氨酸合成的重要措施谷氨酸生产菌应具备的生化特点1.-酮戊二酸氧化能力微弱2.谷氨酸脱氢酶活性强3.细胞膜对谷氨酸的通透性强,理论收率为81.7%。四碳二羧酸是100%通过CO2固定反应供给。若通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸,则理论收率仅为54.4%,实际收率处于中间值。,第二节 谷氨酸生物合成的调节机制,谷氨酸生产菌的育种思路,第三节 谷氨酸发酵过程中细胞膜渗透性的控制,选择性半渗透性膜,控制细胞膜通透性的方法1.控制磷脂合成1）生物素缺陷型 生物素（维生素H、辅酶R）作为辅酶参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂合成。控制关键：生物素亚适量（5-10g/L）,2）添加表面活性剂吐温-60作用机制：对生物素的拮抗作用。控制关键：添加时间与用量3）油酸缺陷型作用机制：阻断油酸合成。4）甘油缺陷型作用机制：丧失了-磷酸甘油脱氢酶,5）温度敏感型2.控制细胞壁的合成 添加青霉素的强制发酵工艺。,谷氨酸生产菌的具体育种思路1.切断或减弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜的渗透性 5.强化能量代谢6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,第一节 谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌 1.棒状杆菌属(Corynebacterium),2.短杆菌属(Brevibacterium)3.小杆菌属(Microbacterium)4.节杆菌属(Arthrobacterium),现有谷氨酸生产菌的主要特征细胞形态短杆形、棒形；革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢，不能运动；需氧型微生物；生物素缺陷型；脲酶强阳性；不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等；,发酵中菌体发生明显形态变化，同时细胞膜渗透性改变；二氧化碳固定反应酶系强；异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱；-酮戊二酸氧化能力微弱；柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活性强；具有向环境泄露谷氨酸的能力；不分解利用谷氨酸，并能耐高谷氨酸，产谷氨酸8%以上；,第二节 国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸生产菌（1）北京棒杆菌（As1.299）突变株：7338、D110、WTH-1（2）天津短杆菌（T613）突变株：TG-961、FM-415、S9114、CMTC6282（3）鈍齿棒杆菌（As1.542）突变株：B9、F-263,第三节 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化种子的菌体形态 斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈单个、成对及V字形,有栅状或不规则聚块;分裂的细胞大小为0.70.9*1.03.4m。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。,谷氨酸生产菌在发酵过程中形态的变化（1）不同发酵阶段的形态长菌期 发酵0-8h，正常状态转移期 发酵8-18h，细胞开始伸长、膨大产酸期 16-20h以后，伸长、膨大，不规则，缺乏八字排列。,（2）感染噬菌体后的形态前期感染 细胞明显减少，形态不规则，发圆、发胖，缺乏八字排列，有明显细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网。中后期感染 形态不规则，边缘不整齐，有毛刺，有细胞碎片。,第四节 谷氨酸发酵的代谢控制育种（1）日常菌种工作定期分纯小剂量诱变刺激高产菌保藏,（2）选育耐高渗透压菌种耐高糖（20-30%）耐高谷氨酸（15-20%）耐高糖、高谷氨酸（20%+15%）（3）选育不分解利用谷氨酸菌株 以谷氨酸为唯一碳源菌体不能生长或微弱,（4）选育细胞膜渗透性好的菌株选育二氨基庚二酸缺陷型抗VP类衍生物：香豆素、芦丁油酸缺陷型甘油缺陷型温度敏感型,（5）选育强化CO2固定反应的菌株以琥珀酸为唯一碳源生长快的菌株。丙酮酸缺陷型（6）强化柠檬酸到-酮戊二酸代谢菌株选育抗氟化钠、氟乙酸菌株（7）选育减弱乙醛酸循环的突变株选育琥珀酸敏感型、不利用乙酸突变株。,（8）解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节抗谷氨酸结构类似物耐高谷氨酸谷氨酰胺抗性菌株酮基丙二酸抗性菌株,（9）强化能量代谢选育呼吸抑制剂抗性菌株，抗丙二酸、氰化钾抗性菌株。选育ADP磷酸化抑制剂抗性菌株，2，4二硝基酚、砷抗性菌株。寡霉素抗性菌株。（10）减弱HMP途径后段酶活性的突变株 选育抗嘌呤、嘧啶类似物的突变株。,第五节 应用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌应用转化法选育谷氨酸生产菌应用转导法选育谷氨酸生产菌应用重组DNA技术构建谷氨酸工程菌应用固定化细胞技术发酵生产谷氨酸,第六节 菌种的扩大培养和种子的质量要求菌种的扩大培养 斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵罐（1）斜面菌种的培养 葡萄糖 0.1%，蛋白陈 1.0%，牛肉膏 1.0%，氯化钠 0.5%，琼脂 2.02.5%，pH 7.07.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。,（2）一级种子培养a.培养基组成 葡萄糖 2.5%，尿素 0.5%，硫酸镁 0.04%，磷酸氢二钾 0.1%，玉米浆 2.53.5%(按质增减)，pH7.0。b.培养条件 500mL 1000mL 1000L 置于冲程7.6cm、频率96次/min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度3334。,一级种子质量要求种龄：12h，pH值：6.40.1光密度：净增OD值0.5以上残糖：0.5以下 无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)(双层平板法、划线法、液体培养法）镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐革兰氏阳性反应。,（3）二级种子培养 为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。培养基组成 水解糖 2.5%，尿素 0.5%，硫酸镁 0.04%，磷酸氢二钾 0.1%，玉米浆 2.53.5%(按质增减)，消泡剂0.5-1kg pH7.0。,种子罐的灭菌空消0.15-0.2MPa 40-60min实消118 5min培养条件 接种量：0.81.0 培养温度：3234 培养时间：78h,通风量：通风比：单位体积发酵液单位时间通过的空气量(v/v.min)50L种子罐1:0.5、搅拌转速340rmin；250L种子罐1:0.3、搅拌转速300r min500L种子罐1:0.25、搅拌转速230r min,二级种子的质量要求 种龄：78h pH：7.2左右 OD值净增0.5左右 无菌检查(-)噬菌体检查(-),影响种子质量的主要因素培养基 氮源丰富、生物素充足、碳源较少。温度 避免温度过高和波动较大pH 0时不宜过高，培养结束不易过低溶解氧 溶氧水平不易过高。接种量 1%-2%培养时间 7-8小时,作业1.叙述双酶法制糖工艺的优缺点。2.叙述谷氨酸生物合成的理想途径。3.谷氨酸生产菌的特点的主要特征。4.一级种子的质量标准是什么？,第四章 谷氨酸发酵控制,谷氨酸生产的影响 内因：具有一定生理特性的菌种。外因：环境因素。,第一节 发酵培养基对谷氨酸发酵的影响碳源目前所发现的谷氨酸产生菌均不能利用淀粉,只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等,有些菌种能够利用醋酸、乙醇、正烷烃等作碳源。我国主要使用：玉米、大米、淀粉、糖蜜。,氮源1.合理的碳氮比：100（15-30）2.氮源的来源 无机氮源:(1)尿素(2)液氨(3)氨水 有机氮源:主要是蛋白质、胨、氨基酸等。谷氨酸发酵的有机氮源常用玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液和糖蜜等。,无机盐1.磷酸盐 磷酸氢二钾：0.1-0.15%过高：代谢转向合成缬氨酸。过低：菌体生长缓慢。2.硫酸镁 0.04-0.06%酶的激活剂,3.钾盐 酶的激活剂 钾含量低涨菌体，多产谷氨酸。4.微量元素生长因子(1)生物素(2)维生素B1,第二节 培养条件对谷氨酸发酵的影响 温度对谷氨酸发酵的影响1.温度影响细胞中酶的活性,而影响代谢速度、途径方向2.酶是蛋白质，受热容易失活，温度愈高失活愈快,菌体易衰老,影响发酵液的性质来间接影响发酵。3.影响基质和氧的溶解从而影响发酵4.微生物最适的生长温度范围,pH值对谷氨酸发酵的影响1.pH值对谷氨酸发酵的影响（1）酶的活性（2）细胞膜所带电荷（3）物质的离解（4）代谢途径,2.发酵过程pH 值的变化及控制 pH的变化反应谷氨酸发酵的重要指标 控制：流加尿素、液氨、氨水。,供氧对谷氨酸发酵的影响1.溶解氧与谷氨酸的需氧量葡萄糖氧化的需氧量：彻底氧化1：6合成代谢产物：1：1.9必须连续向发酵液通入氧。,2.供氧对谷氨酸发酵的影响 菌体生长期：满足菌体合成的需要，过低，副产物增加，影响菌体收率。过高抑制生长。产酸期：最大满足呼吸需氧量。3.供氧与其他发酵工艺条件的关系4.氧对发酵影响的微生物生理学考察,二氧化碳对谷氨酸发酵的影响1.间接控制通风量 排风中二氧化塘控制在13%2.提前发现噬菌体感染3.帮助发现杂菌感染,第三节 泡沫的消除泡沫对发酵的影响1.发酵液逃逸2.感染3.降低装填系数，设备利用率降低4.影响氧传递,泡沫的消除1.消泡的方法（1）机械消泡（2）化学消泡 添加消泡剂：BAPE、PPE,第四节 发酵工艺,一次高糖发酵工艺1.培养基 水解糖15%-18%玉米浆0.4-0.5%磷酸氢二钾0.1-0.15%硫酸镁0.04-0.06%消泡剂0.03%尿素0.5%,2.工艺控制前期 温度33-34 pH7.2-7.5 通风比1：中期 温度35-36 pH7.2-7.5 通风比1：后期 温度36-37 pH7.0-7.2 通风比1：,常见的异常发酵现象及其处理方法,第五节 糖蜜原料强制发酵工艺表面活性剂的添加 0.2%吐温-60青霉素的添加 3-5单位/mL发酵液工艺特点：大接种量（5-10%）高生物素（100g/L）高通风量（1：0.3）,低糖流加工艺工艺特点 初糖浓度低、总投糖量多、产酸高。糖流加方式 连续流加 分段加入,提高发酵产率的主要措施一、选育优良菌株二、改进发酵工艺1.一次高浓度糖发酵2.降低发酵初糖浓度,连续流加糖发酵3.混合碳源发酵4.应用电子计算机控制和管理发酵,使发酵工艺最佳化5.固定化活细胞连续发酵生产谷氨酸,第五章 噬菌体与杂菌的防治,噬菌体对谷氨酸发酵的危害,轻则减产,重则会引起发酵液全部倒弃,造成严重埙失。谷氨酸生产菌的噬菌体,一般在25-35、pH5-9时较为稳定,易受热变性（60-70,10-15min),对氧化物敏感,可被酸碱致死。凡能引起蛋白质变性的化学药品都可以使噬菌体失活。,噬菌体检查方法双层平板法划线法液体培养法,1.噬菌体污染 出现“二高三低”现象发酵液OD值不上升或者回降产酸低发酵温度低pH升高，可到8.0以上残糖高,（1）噬菌体污染的防止措施 以环境净化为中心的综合治理定期检查噬菌体严禁活菌体排放杀灭环境中的噬菌体杀灭压缩空气中的噬菌体严格无菌操作避免噬菌体侵入设备,（2）污染噬菌体后的挽救措施并罐法（噬菌体不能侵染产酸期细胞）菌种轮换（不交叉感染）放罐重消法（高温灭菌）低温灭菌法,2.杂菌的污染与防治（1）染菌原因分析从染菌时间分析早期：培养基灭菌不彻底中后期：设备渗漏、空气系统,从染菌类型分析芽孢杆菌：灭菌不彻底球菌、酵母等：设备渗漏从染菌幅度分析个别罐：参照上面大面积罐：空气系统、种子,（2）预防措施空气净化培养基和设备灭菌设备安装接种操作,（3）补救措施补加种子补加糖直接放罐,第六章 谷氨酸的提取,第一节 概 述将谷氨酸生产菌在发酵液中积累的L-谷氨酸提取出来,再进一步中和、除铁、脱色、加工精制成谷氨酸单钠盐叫提炼。分为：提取和精制在提取车间和精制车间完成。,谷氨酸是发酵的目的物,它溶解在发酵液中,而在发酵液中还存在菌体、残糖、色素、胶体物质以及其他发酵副产物。提取工艺的选择原则:工艺简单,操作方便,提取收率高,产品纯度高,劳动强度小,设备简单,造价低,使用的原材料、药品价廉,来源容易。,主要提取方法简介(1)等电点法(2)离子交换法(3)等电-离交法(4)连续等电点法(5)金属盐法(6)盐酸水解-等电点法(7)离子交换膜电渗析法提取谷氨酸,第三节等电点法提取谷氨酸等电点法提取谷氨酸的原理 等电点法是谷氨酸提取方法中最简单的一种方法,由于设备简单、操作简便、投资少等优点,谷氨酸发酵液不经除菌或除菌、不经浓缩或浓缩处理、在常温或低温下加盐酸调至谷氨酸的等电点pH3.22,使谷氨酸呈过饱和状态结晶析出。,（1）常温等电点法 发酵液调节pH4.0-4.5 育晶2-4h 调节pH4.0-4.5 育晶2-4h 缓慢调至pH3.0-3.2 育晶2h 冷却降温搅拌16h 静止沉淀2-4h 离心分离湿谷氨酸,（2）低温等电点法提取谷氨酸与常温等电点操作基本相同，差别在于最后终点温度为0-5（3）除菌体常温等电点法（4）浓缩、水解等电点法（5）低温浓缩等电点法（6）谷氨酸发酵液连续等电工艺,谷氨酸的结晶1）谷氨酸的晶型和性质-型谷氨酸 斜方六面晶体、纯度高、颗粒大、质量重，易分离。-型谷氨酸 粉状或针状，纯度低、晶粒微细、难分离。,2）影响谷氨酸结晶的主要因素菌体谷氨酸浓度温度加酸速度起晶方式残糖,第四节 离子交换法提取谷氨酸,离子交换法提取谷氨酸的原理 当pH3.2时，谷氨酸以GA-存在 当pH3.2时，谷氨酸以GA+存在 可以用阳离子树脂提取谷氨酸阳离子树脂吸附顺序：Ca2+Mg2+K+NH4+Na+丙氨酸亮氨酸谷氨酸天冬氨酸,吸附（目的物的分离）清洗（清除杂质）洗脱（目的物的收集）再生（树脂的再生）水洗（pH接近中性）,离子交换工艺流程1.单柱法等点母液强酸型阳离子树脂（交换、洗脱）高流分调酸做酸使用（等点提取）,2.双柱法等点母液弱酸型阳离子树脂（除去杂离子）强酸型阳离子树脂（吸附、洗脱）高流分调酸做酸使用（等点提取）,等电点离子交换法提取谷氨酸,发酵液,加盐酸（或高流分母液pH1.5),育晶2h(pH4-5),育晶2h(pH3.5-3.8),加盐酸（或高流分母液pH1.5),育晶2h(pH3.0-3.2),加盐酸（或高流分母液pH1.5),搅拌育晶20-16h,沉淀4h,细谷氨酸,母液,谷氨酸,上离子交换柱,洗脱,后流分,高流分,初流分,第七章 谷氨酸制味精,谷氨酸制味精的工艺流程谷氨酸中和脱色浓缩结晶干燥过筛包装成品,谷氨酸,中和,沉淀,脱色,过滤,脱色,过滤,浓缩结晶,离心分离,小结晶,母液,结晶味精,干燥,拌盐粉碎,粉状味精,水(或渣水),碳酸钠,活性炭,硫化碱,谷氨酸回调pH,活性炭脱色,活性炭二次脱色,硫化碱,晶种,流加母液,蒸馏水,GH15颗粒活性炭脱色,干燥,过筛,粉状味精,活性炭,硫化碱,1.谷氨酸的中和 2C5H9NO4+Na2CO32C5H8NO4Na+CO2+H2O 100kg谷氨酸需要36.1kgNa2CO3 C5H9NO4+NaOHC5H8NO4Na+H2O 100kg谷氨酸需要40kgNaOH,中和工艺条件 中和液浓度：21-23Be 温度：60-70 lgs=0.5331+0.01613t（s：g/kg水）pH：,2.中和液的除铁硫化钠法离子交换法3.中和液的脱色粉末活性炭 温度:55-60 pH：用量：0.2-0.5%时间：30min,GH-15碳柱脱色 预处理 脱色 水洗 再生,4.浓缩结晶结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出；,结晶的步骤过饱和溶液的形成晶核的形成晶体生长,工艺流程 浓缩 起晶 整晶 育晶 养晶,结晶的过程通常包括晶核的形成和晶体的长大两个阶段。首先在溶液中产生细小的晶核,随后以这些晶核为中心,继续在晶核表面吸附周围溶质分子,使晶粒不断长大。工业生产上结晶有三种不同起晶方法:(1)自然起晶法(2)刺激起晶法(3)晶种起晶法 晶种起晶法是一个普遍被采用的方法。,结晶工艺参数 真空度：温度：60-70 浓度：波美 底料量：罐容积55%-65%补料量：罐容积倍 晶种量：40目：罐容积3-5%30目：罐容积6-9%20目：罐容积6-12%,味精生产中异常现象及其处理1.味粉浑浊现象：溶解后，溶液浑浊，透光率下降。原因1）硫化钠过量2）消泡油过量3）L-谷氨酸消旋4）原材料质量差,解决措施1）控制原材料质量2）严格执行工艺要求3）控制硫化钠的用量2.味精中含有白片现象：味精透明度低，有白色片状物质原因：底料液面低于加热面。解决措施：严格控制料液液面。,3.味精中含有焦谷氨酸钠现象：纯度下降、鲜味降低、易吸潮原因1）中和、脱色温度过高2）味精烘干温度高3）浓缩结晶温度高、时间长4）母液循环次数过多，焦谷氨酸钠积累解决措施：控制各环节温度、pH。,4.味精光泽度差现象：味精发乌，无光泽。原因1）浓缩结晶温度高2）贮晶槽浓度偏高、母液滞留结晶表面3）干燥温度高、结晶表面失水松花4）筛选震动筛频率过高，磨损晶体表面,解决措施1）控制温度，防止失去结晶水。2）控制浓度，母液应分离干净3）控制好干燥温度和时间4）调整好震动频率，缩短物料停留时间,5.味精带有颜色现象：味精发黄、红、灰等颜色原因1）味精发黄色素混入母液分离不净干燥温度过高、时间长色素洗脱带入味精,3）味精发红除铁不净接触铁器树脂、碳柱再生不彻底4）味精发灰、发青活性炭粉末混入硫化钠过量,4）味精久放变黄亚铁离子氧化谷氨酸残糖含量高，结晶体发黄，吸潮后更黄。解决措施1）除铁彻底2）提高谷氨酸质量3）加强工艺操作控制,6.味精发臭现象：味精有异味原因：杂菌污染解决措施加强环境卫生,7.味精大小头或细长现象：颗粒不均匀、晶体细原因：1）处理伪晶水过多，分布不均匀2）洗水温度高、水量大3）晶种质量差处理措施：控制水量、提高晶种质量,8.并晶现象：晶体粘连、结块原因：1）浓度过高、粘度大而结块2）料液在贮晶槽停留时间长、温度下降3）分离操作问题解决措施：控制浓度与分离操作。,9.味精发脆现象：晶体硬度低、易破碎原因：1）谷氨酸质量差2）结晶操作问题3）干燥时间长，晶体失水4）母液循环次数过多解决措施：提高原料质量、合理操作、选择合适干燥设备、减少母液循环次数。,第八章 谷氨酸清洁生产,味精工业重污染行业突出问题：资源浪费与环境污染废水、废渣的排放造成水体富营养化清洁生产的最终目标：零排放。任重道远,一、谷氨酸发酵工业废水的性质特点：1）有机物和菌体含量高2）酸度大3）高氨氮和高硫酸盐4）对好养和厌氧生物有直接和间接毒性,发酵废液的主要成分1）无机盐2）菌体等蛋白悬浮物3）微量代谢副产物4）残糖,二、谷氨酸生产工艺污染来源淀粉水解糖的制备 采用双酶法制糖，无有机废水排放，主要为冷却水、冲洗水。谷氨酸发酵 菌体和代谢副产物,谷氨酸提取 等点母液 离子交换尾液、树脂洗涤再生液。味精的精制 洗涤废水,提取谷氨酸闭路循环工艺,发酵液,等点提取,脱色,离心分离,除菌体,浓缩,脱盐,焦谷氨酸开环分离,酸性脱水液,谷氨酸,菌体蛋白,冷凝水,硫酸铵,有机肥,发酵废液提取菌体蛋白工艺1.高速离心法采用碟片式离心机回收菌体和提高收率缺点：发酵液损失,2.絮凝沉降法技术关键：合适的絮凝剂 要求：无毒、无害、无异味 脱乙酰甲壳素絮凝条件影响：温度、pH、离子、絮凝剂分子量、搅拌,缺点：运行费用高 工艺复杂加热分离菌体工艺,母液,沉降分离,泥浆,滤渣,干燥,产品,清液,3.膜分离法除菌体谷氨酸生产菌大小0.7-3m,谷氨酸发酵母液生产饲料酵母,味精废母液,中和,酵母培养罐,离心分离,滚筒干燥,磨碎,酵母粉,菌种,工艺条件：温度：30度pH：4.0接种量：10%菌种：热带假丝酵母,谷氨酸发酵母液浓缩生产复合有机肥1.生产硫铵复合肥,酸性废水,NH3中和,浓缩结晶,分离,干燥,硫铵复合肥,SBR废水处理,SBR是序列间歇式活性污泥法（Sequencing Batch Reactor Activated Sludge Process）的简称，是一种按间歇曝气方式来运行的活性污泥污水处理技术，又称序批式活性污泥法。,2.离交尾液浓缩生产有机肥料,发酵液,离心分离,浓缩,冷冻等电点,离心分离,谷氨酸,菌体蛋白,干燥,饲料蛋白,母液,中和,有机复合肥,谷氨酸发酵废水生物处理工艺好氧+厌氧生物氧化方法厌氧：UBF,流式污泥床过滤器(,)UASB：上流式厌氧污泥床好养 SBR：序列间歇式活性污泥法,废水处理的几点建议1）综合利用后再进行废水处理2）造纸与味精行业废水联合处理3）不建议采用稀释法4）好氧、厌氧生物氧化方法均适用5）选择经济有效的方法,第十章 氨基酸生产菌的选育与发酵技术,第一节 氨基酸生产菌的选育与定向育种思路选育抗代谢调节突变株 选育结构类似物抗性菌株1）优点获得氨基酸生产菌的有效方法生产稳定方法简便易于保存，不易回复突变,2）结构类似物作用机理与变构酶的变构部位结合阻遏酶的合成抑制氨酰基-tRNA合成酶活性抑制对应氨基酸向细胞内摄取,3）增强结构类似物抑制生长的方法改变碳源或氮源添加抑制剂选择缺陷菌株添加合成酶的抑制剂增大结构类似物的细胞膜透性,优先合成转换增加前体物质的积累除去终产物选育条件突变菌株选育不生成副产物菌株选育代谢拮抗物质菌株,第二节 用细胞内基因重组手段选育氨基酸生产菌细胞内基因重组是自然界普遍存在的现象，称为杂交育种。原生质体融合转导转化原生质转化,一、利用原生质融合技术选育氨基酸生产菌原生质融合 将遗传性状不同的两个细胞融合称为一个新细胞的技术。便于筛选融合子的方法：亲株通常均要带有抗性或营养缺陷遗传标记，且遗传标记基因不一定与目的基因连锁。,原生质体的获得 影响原生质体形成的因素：菌体生理状态、菌体的前处理、酶的浓度、酶解时间、酶解温度等。（1）菌体处于对数生长期后期；（2）添加甘氨酸、青霉素、D-环丝氨酸；（3）控制酶的浓度、作用时间；（4）破壁后置于高渗环境。,原生质体形成率：,菌数可采用平板计数法计量,原生质体的再生再生：指原生质体能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、繁殖，是原生质融合育种的必要条件。影响的因素：菌种自身特性、原生质体制备的条件、再生培养基的成分、再生培养条件。,原生质融合融合促进剂 聚乙二醇（分子量1000-6000）浓度：40%左右 Ca2+：50-100mmol/L pH：碱性有利于提高融合频率,电场诱导（1）影响因素 电场梯度、溶液导电性、交流电场的频率和强度等（2）特点 融合频率高、重组几率大、操作简单快捷。,细胞融合仪,AJ11082,AJ11638,震荡培养,添加青霉素,离心,高渗溶液洗涤,酶解,离心,等量混合的原生质体,加PEG融合,离心,悬于pH10.5高渗溶液,高渗选择培养基再生,挑选融合子,性能鉴定,赖氨酸生产菌选育,WY10,ASl.495,震荡培养,添加青霉素,离心,高渗溶液洗涤,酶解,离心,等量混合的原生质体,加PEG融合,离心,悬于高渗溶液,高渗选择培养基再生,挑选融合子,性能鉴定,L1异亮酸生产菌选育,二、利用转导法选育氨基酸产生菌 转到作用：利用转导噬菌体为媒介将供体菌部分DNA片段导入受体菌，从而使受体菌获得供体菌部分遗传性状的现象。三个必需组成供体菌受体菌转导噬菌体,供体菌,扩大培养,加入噬菌体,继续培养,氯仿杀菌,离心,上清液,DNase处理,微孔膜过滤,裂解液,受体菌,扩大培养,混合,离心,受体菌体,选择培养基,转导子,性能鉴定,转导育种操作,利用转导法选育组氨酸产生菌选育的关键：解除组氨酸生物合成过程的反馈抑制与阻遏；同时，组氨酸酶缺陷。,Hd-16（Hase-）,亚硝基胍诱变,HdMHr581（Hase-+2-MHr）,HdTr142、HdTr51（TRAr+Haser）,P20转导,HT2892（Hase-+2-MHr+TRAr）,利用转导法选育精氨酸产生菌选育关键：精氨酸合成系统酶不受阻遏、初始酶的反馈抑制脱敏、精氨酸分解能力丧失。,RA4240,PA3179（Lys-）,ArgA+LysA共转导,转导子（Lys+）,AT404,利用转导法选育苏氨酸产生菌选育关键：生物合成限速酶AK和DH、与苏氨酸分解相关的苏氨酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶。产生菌具备：（1）苏氨酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶缺陷（2）解除AK和DH的反馈调节,8000（野生菌）,Mu-910（TDH-）,D-60（TDH-+TD-）,HNr31,HNr59（解除反馈阻遏）,HNr21（解除反馈抑制）,AECr174,N-11,E-60,T-570,T-693,转导,转导,苏氨酸转导育种,三、利用原生质体转化法选育氨基酸生产菌转化：相当大的游离的供体细胞DNA片段被直接吸收到受体细胞，并整合到受体细胞的基因组中，从而使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。供体DNA制备受体细胞对DNA吸收转化子的选择,供体菌,制备DNA片段,受体菌,制备原生质体,PEG转化,选择培养,转化子,性能鉴定,第三节 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌 重组DNA技术亦称基因工程 定向育种的重要技术工具酶限制性内切酶DNA连接酶,寄主-载体系统 质粒是重要的载体。载体的要求1）较小的分子质量2）选择性标记3）高表达的启动子4）数种限制内切酶的单位切点5）能在寄主细胞中多拷贝复制,供体菌,DNA片段,质粒,重组质粒,受体菌,选择培养基,转化子,重组DNA技术,第四节 氨基酸产生