《植物病毒》PPT课件.ppt

第四章 植物病毒,病毒（virus）:是一组（一种或一种以上）被包围在蛋白或脂蛋白外壳内的DNA或RNA核酸分子。在合适的寄主细胞内借助于寄主蛋白合成体系、物质和能量来完成自身的复制，并伴随核酸突变而发生变异。主要特征：结构简单的（核酸+蛋白或脂蛋白衣壳）；严格专性寄生的（依赖寄主的核酸和蛋白质合成系统）；非细胞生物（分子寄生物）。根据病毒的寄主类型，习惯上将病毒划归为下列几大类群：寄生植物的称为植物病毒（plant virus）；寄生动物的称为动物病毒（animal virus）；医学病毒（人类病毒）；真菌病毒；寄生细菌的称为噬菌体（细菌病毒 bacteriophage）。,第一节 概述,一、病毒的定义,二、病毒与人类的关系,有害方面：,有益方面：,引起人类疾病（天花、爱滋病、非典型肺炎、肝炎、流感、小儿麻痺等）。引起畜禽疾病（狂犬病、口蹄疫、猪瘟、牛瘟、鸡瘟、鸭瘟）。引起植物病害。,用作基因工程的载体或元件。有害生物控制（害虫、真菌及杂草生防）。环境保护（利用藻类病毒消除水面藻类污染）。花卉增色（金心黄杨、金边瑞香、杂色郁金香）。,非典型肺炎”元凶冠状病毒,非典型肺炎”元凶冠状病毒（单个放大的）,目前已研究和命名的植物病毒达1000多种，其中许多为重要的植物病原，其所造成的损失仅次于真菌病害。如：水稻东格鲁病（Rice tungro）在东南亚一些国家是最具有毁灭性的病毒病，上世纪中期仅菲律宾每年因此病所致的稻谷损失即达140万吨；水稻矮缩病（Rice dwarf）于19世纪末在日本一些地区流行，曾因此饿死1万多人；在我国北方麦区间歇性暴发的小麦黄矮病（Barley yellow dwarf）平均造成30%的产量损失。在油菜上，因病毒病造成的产量损失常年达2030%。甜菜曲顶病（Beet curly top）、香蕉束顶病（Banana bunchy top）等几乎对一些产区造成了毁灭性打击。,小麦黄矮病,三、病毒在生物中的地位,生物,细胞生物,分子生物,原核生物,原核生物界,真核生物,动物界,植物界,菌物界,原生生物界,病毒界？,真病毒,亚病毒,类病毒,拟病毒,朊病毒,公元10世纪（北宋），人工免疫预防天花（中国）。1798，英国人Edward Jenner发明牛痘疫苗。1576，荷兰人Charles de Lieclase描述郁金香杂色花。“郁金香热”。一株郁金香（球根）：数头牛、猪、绵羊；几顿谷物；上千磅奶酪；一个磨坊。1886年，德国人梅耶尔（Mayear）证明烟草花叶病（TMV）具有传染性（认为是细菌）。1892年，俄国人伊凡诺夫斯基（Ivanowski）发现烟草花叶病病原（TMV）可以通过细菌过滤器（认为是微小细菌）。1898年，荷兰人伯杰林克（Beijerinck）重复上述研究，提出病原不是细菌，而是“可过滤性病毒”。提出“病毒”概念，被称为“病毒学之父”。,四、植物病毒学发展简史,1、病毒的发现,2、对病毒本质的认识（病毒理化特性）,1935年，美国的斯坦利（Stanley）提纯TMV结晶，于1946年获诺贝尔化学奖。1936年，英国的鲍登（Bawden）发现TMV含有95%的蛋白质和5%的RNA。1939年，美国的凯奇（Kausche）获得第一张TMV电镜照片。1944年，美国的斯克诺定尔（Schrodinger）发表了“What is Life?”小册子。3、近代分子生物学时期 1956年，Gierer，Fraenkel-conral等证明TMV的RNA具有侵染性。1971年，Diener发现类病毒。1982年，Prusiner发现朊病毒，获1997年诺贝尔奖。4、现代分子生物学时期 1985年，Powell等获得首例转TMV CP基因烟草。,五、植物病毒学发展现状与热点问题,1、病毒基因组及基因功能研究；2、病毒与寄主植物相互关系研究；3、生物技术（转基因）培育抗病品种；4、病毒作为基因工程载体及载体元件的研究。,由于分子生物学的发展和电子显微镜的进步，对植物病毒的形态、结构、生物学特性及理化特性都有深入的研究。近年来对植物病毒的研究已进入分子水平，内容包括：,病毒粒体：是病毒的基本存在形式（形态）。病毒粒体的形态微小，只有在放大数万倍的电镜下才能观察到，其度量单位通常采用纳米（nm，1nm=10-9m）。植物病毒粒体形态主要有：球状、线状、杆状、弹状、双联体状、丝线状、柔软不定形等。,第二节 植物病毒的一般性状,一、植物病毒的形态,许多植物病毒由不只一种粒体构成。烟草脆裂病毒有两种杆状粒体，长的一种为19525 nm，短的一种为4311025 nm；苜蓿花叶病毒有5种粒体组分：大小为5818、5418、4218、3018、1810 nm。一些球状病毒也有多种粒体组分，但这些粒体形态相同，只是其中所包含的核酸含量不同而重量存在差异。这些病毒被称为多分体病毒（multicomponent virus），必需有多种病毒粒体组分同时侵染寄主细胞，才能增殖并完成其生物学功能。,二、植物病毒的结构,植物病毒粒体主要含有核酸和蛋白两大部分。中间为核酸芯（RNA或DNA），外部有外壳蛋白（Coat Protein，CP）包被形成衣壳，少数病毒在蛋白衣壳外面还包被一层那囊膜（envelope），称为包膜病毒,如植物弹状病毒。,植物病毒粒体,杆状或线状病毒：蛋白质亚基螺旋状排列，中间是一个由核酸构成的空心管子，核酸也呈螺旋状排列，嵌入到螺旋状排列的蛋白质亚基内端。如，TMV杆状粒体。,TMV结构模式图,TMV：含2130个蛋白质亚基；排成130圈；每3圈一个周期，49个亚基/3圈；2.3nm亚基间隔/圈。病毒粒体直径18nm，核酸链直径8nm。,球状病毒：蛋白质亚基镶嵌在粒体表面，构成多面体形，内心是病毒的核酸；球状病毒并非光滑的球体，而是多面体（多为二十面体），由多个正三角形组合而成。,植物病毒的主要成份是核酸和蛋白质，有些还含有少量的金属离子、多胺和水等。,三、植物病毒组分及其生物学功能,（一）核酸 核酸是病毒遗传信息的载体，植物病毒粒体的基因组主要在核酸中，有些含mRNA。一套基因组含有病毒侵染、复制、运转、传播等生命活动所需的全部基因，决定病毒的增殖、生物学特性及致病性等。植物病毒基因组所包含的基因数目从一个（卫星病毒）至十二个（植物呼肠孤病毒），一般有47个基因，分子量从0.4106d到15.5106d，通常有外壳蛋白基因、复制酶基因及运动蛋白基因等。大部分植物病毒基因组能编码47种蛋白质。,1、植物病毒的核酸类型 植物病毒的基因组多数为核糖核酸（RNA），少数为脱氧核糖核酸（DNA）。根据核酸性质及功能，可将植物病毒基因组分为下列5种类型：（1）正单链RNA（+ssRNA）单链RNA具有侵染性，可以直接翻译蛋白，起mRNA的作用。大部分重要植物病毒的基因组属这一类型。占70%以上，如TMV，CMV，PVY；多分体病毒等。（2）负单链RNA（-ssRNA）病毒粒体中的单链RNA不具侵染性，必需先转录成互补链，才能翻译蛋白。植物弹状病毒的基因组属这一类型。如小麦丛矮病毒。（3）双链RNA（dsRNA）其中一条链具有mRNA的作用。负链转录出正链才能作为mRNA翻译蛋白。植物呼肠孤病毒的基因组属这一类型。水稻矮缩病毒。,（4）单链DNA（ssDNA）联体病毒科（Geminiviridae）病毒含有这种类型基因组，复制时单链DNA先合成双链DNA，再以常规途径转录生成mRNA。（5）双链DNA（dsDNA）核酸类型与高等动、植物的相同，为互补的双链DNA，花椰菜花叶病毒属（Caulimovirus）、杆状DNA病毒属（Badnavirus）具有这种类型基因组。2、病毒粒体核酸含量 球状病毒：15%45%。线状及杆状病毒：5%6%。弹状病毒：1%。,3、病毒的多分体现象,单体基因组：病毒基因组分布于一条核酸链上。分段基因组：病毒基因组分布于多条核酸链上。单分体病毒：一个病毒粒体中包含有全套基因组。多（双、三）分体病毒：分段基因组分别包装于不同的病毒粒体中。,（二）蛋白质,植物病毒的基因组很小，编码的蛋白质种类也很少，按照其功能可分为结构蛋白和非结构蛋白。结构蛋白是构成一个完整病毒粒体所需要的蛋白，主要是外壳蛋白（coat protein，CP）和囊膜蛋白，有些病毒还有基因组结合蛋白（VPg），由于大多数植物病毒没有囊膜，其结构蛋白也就只有外壳蛋白。并且绝大多数植物病毒的外壳蛋白仅由一种蛋白多肽构成，个别的有两种以上。,非结构蛋白是指病毒基因编码的非结构必需的蛋白，包括病毒复制需要的复制酶、参与病毒运转的运动蛋白等。,（三）脂类,大多数植物病毒不含脂类，只有具囊膜的病毒才有脂类。,（四）其他组份,糖蛋白、金属离子、多胺、水等。,第三节 植物病毒的侵染和传播,大多数植物病毒是从机械的或传毒介体所造成的微伤（fine wound）侵入寄主，少数经过内吞（endocytosis）作用，包膜病毒通过融合（fusion）方式进入寄主细胞。植物病毒没有细胞结构，不像大多数生物那样具有复杂的繁殖器官进行有性或无性繁殖，也不像细菌那样进行裂殖生长，而是分别合成核酸和蛋白质再组装成子代病毒粒体。这种特殊的繁殖方式称为复制。,一、植物病毒的侵染和复制,植物病毒利用寄主细胞核酸复制系统及蛋白质合成系统复制其基因组和合成其专化性蛋白,病毒侵染植物后，在活细胞内增殖后代需要两个步骤：一是病毒核酸的复制（replication），即病毒的基因传递；二是病毒基因的表达（gene expression），即病毒蛋白质合成。一般新增殖的病毒会在体内进行胞间运转和长距离运转。植物病毒核酸的复制 大部分植物病毒的核酸复制是由RNA到RNA。病毒核酸的复制需要寄主提供复制的场所（通常是在细胞质或细胞核内）、复制所需的原料和能量、部分寄主编码的酶及膜系统。病毒自身提供的主要是模板和专化的聚合酶，即复制酶。如花椰菜花叶病毒编码一种依赖于RNA的DNA聚合酶，也称反转录酶。,根据核酸种类和性质不同，植物病毒复制可分为多种类型。以（+）RNA病毒为例，病毒的复制过程如下：（1）病毒粒体进入寄主细胞，脱壳，释放RNA；（2）RNA与核糖体结合，翻译出病毒复制酶等与复制相关的基因产物；（3）复制酶以（+）RNA为模板合成（-）RNA链，并形成双链复制型；（4）从复制型产生子代（+）RNA链；（5）以病毒RNA为模板合成外壳蛋白；（6）外壳蛋白亚基和RNA组装形成新的病毒粒体。,植物病毒基因组复制及mRNA合成途径具有多样性,病毒粒体进入寄主细胞,脱壳,基因表达,复制大量的基因组及合成外壳蛋白,病毒粒体装配,植物病毒的增殖,植物病毒基因及其表达,植物病毒的基因组较小，许多植物病毒的基因组全序列及基因图谱都已明确。,以TMV为例,TMV基因组RNA全长6395nt+ssRNA5-未端具有帽子结构和先导序列（非转译序列）3-未端有类似tRNA的结构整个基因组含有5个开读框（ORF），翻译产生5种蛋白,植物病毒基因表达所面临的问题：真核生物蛋白质合成系统仅识别病毒RNA上的第一个开放阅读框架，同一核酸链上的其它基因的表达则要借助病毒的特殊翻译策略。,在真核生物蛋白合成系统中的翻译策略（共5种策略）,1、亚基因组策略,2、多聚蛋白策略,3、多分体基因组策略,4、通读蛋白策略,5、核糖体移码策略,由基因组3-未端转录产生一至多个亚基因组RNA，从各个亚基因组5-端开读框翻译出功能性蛋白产物。如TMV,基因组仅含一个开读框，翻译产生一个前体蛋白（多聚蛋白），再在蛋白酶作用下分解为多个功能蛋白。如马铃薯Y病毒科,基因组为多条核酸链，每条链翻译产生一个蛋白产物。如CMV,核糖体读越过终止密码。如TMV的复制酶蛋白,在翻译接近终止密码时，核糖体回读或跳过一个核苷酸，从而使终止密码失效（解体到两个三联体密码中）,病毒在复制表达过程中会产生一定形状的内含体（inclusion body），可在一般光学显微镜下看到。在细胞核内，称为核内含体；在细胞质内，称为细胞质内含体（主要分为不定形内含体、假晶体、晶体内含体和风轮状内含体）。不定形内含体是由病毒粒体和寄主细胞成份混合组成的；晶体状内含体一般是由病毒粒体整齐排列堆叠而成。,六角形内含体,四边形内含体,晶体状内含体,细胞质内的不定形内含体,细胞质内圆盘状内含体,细胞质内风轮状内含体,植物病毒的变异,1、突变,2、基因重组,3、假重组,自然界中，病毒复制一次出现突变株的概率为10-610-8,人工诱变（亚硝酸盐、高温处理）获得弱毒株及其利用,有的情况下，仅仅一个碱基的变化就会导致病毒性质的变异,两个病毒基因组在复制过程中发生核酸序列交换，形成重组基因组。常发生于DNA病毒中（主要是动物病毒和噬菌体，花椰菜花叶病毒也有发生）,分段基因组病毒之间核酸链的重新组合。如CMV、TBV,运转（移动），即病毒从植株的某一部位扩散到另一部位的过程（植株内扩散）。在植物叶肉细胞间的移动称为胞间运转（移动）；经维管束输导组织的运转称为长距离运转（移动）。（一）胞间运转 已知植物病毒的胞间运转有多种途径，而以经胞间连丝的运转最为普遍。该过程需有病毒的运动蛋白参与。其过程：首先运动蛋白作用于胞间连丝，使胞间连丝的孔径增大几倍至几十倍；同时运动蛋白与病毒核酸结合，使核酸呈细长的线状；最后病毒是以核酸的形式通过扩展了的胞间连丝进入相邻的细胞。,二、病毒在植物体内的运转（移动）,一些病毒仅能在某些寄主的接种点附近作有限的细胞内扩散，表现为局部侵染。一些病毒为韧皮部限制病毒（phloem-limited virus），即病毒经介体传入寄主韧皮部后，仅能在韧皮部增殖和运转。病毒在细胞间移动的速度是缓慢的，平均每天不过1mm左右。（二）长距离运转植物病毒的侵染大都是系统性的；先在薄壁细胞组织中增殖和运转；然后进入维管束组织的韧皮部或木质部很快地运转。,（三）病毒在植物体内的分布,全株性侵染的病毒并不是植株的每个部分都有病毒，因只有部分病毒可以进入植株的种胚，所以病毒可以由种子传染的是少数。有少数病毒可以进入花粉，故花粉就可以传染这些病毒。植物旺盛生长的分生组织很少含有病毒，如茎尖、根尖。因此切下茎端小段（0.10.25cm）分生组织培养，可以得到无病毒的植株。马铃薯、大理菊、草莓等营养繁殖的作物，采用分生组织培养的方法，可以从病株上得到无毒苗。分生组织培养不一定都能得到无毒苗，要经过反复测定确定不带病毒后，再用于繁殖无性系。,三、植物病毒的传播,传播，病毒从一株植物扩散到另一株植物的过程（植株间扩散）。植物病毒只能被动传播，需借外界因子进入活的细胞内。植物病毒为专性寄生物，不能离开活细胞。植物病毒传播方式可以分为介体传播和非介体传播。（一）植物病毒的介体传播 介体（vectors），可以传播病毒的生物体。1、介体传毒特性（1）传毒过程 持毒期：介体一次获毒后，能保持传毒能力的时间。,获毒期,潜伏期,传毒期,（2）介体传毒方式 按照介体与植物病毒之间的生物学关系，可分为非持久性病毒（nonpersistent virus）、半持久性病毒（semipersistent virus）和持久性病毒（persistent virus）三种类型。非持久性病毒 获毒期、潜伏期、传毒期、持毒期均很短（几秒至几分钟），蚜虫传毒多属于此类，又称为口针传毒，蚜虫试探性取食即可传毒。特征是传毒介体在病植株上获毒饲育后病毒依附于口针里，在接种饲育时随同排出的唾液进入寄主植物体内，因此介体饲毒短时间后即可传毒，饲育期延长会降低传毒效率，病毒在介体体内没有循回期，传毒时间也很短。,持久性病毒 获毒期、潜伏期、传毒期、持毒期均较长（几小时至几天、十几天），病毒可进入介体血液循环系统，甚至在介体内增殖，介体获毒后，有的可终生传毒或经卵由子代传毒。叶蝉、飞虱等传毒多属于此类。饲毒时间较长，介体饲毒后病毒随唾液吸入到肠道，渗透过肠壁进入血淋巴，最后循回到口器的唾液腺里，取食时随唾液进入植物体内。因此必须经过一定时期的循回期才能传毒，有的病毒在虫体内能增殖，一次获毒后可终生传毒，有的还可经卵传毒给下一代。半持久性病毒 介于上述两者之间，介体获毒饲育期和传毒时间均较长，病毒在介体体内没有循回期，也不能在虫体内增殖。昆虫蜕皮后即失去传毒能力。,有时，介体与病毒之间具有专化性：某一介体只传某一病毒或某些病毒，某一病毒只经某一或某些介体传播。多介性病毒如CMV可通过桃蚜、棉蚜、豆蚜等81种蚜虫传播。多传性介体如桃蚜可传播100多种病毒。单介性病毒如大麦黄矮病毒二叉蚜株系仅靠二叉蚜传播。蚜虫传播的病毒常引起花叶型、环斑型及黄化型和卷叶型症状，大都属于非持久性病毒，这类病毒都很容易汁液摩擦传播。叶蝉传播的病毒大都属于持久性病毒。,（3）介体传毒的专化性,2、昆虫介体 是植物病毒自然传播的主要途径。其中，同翅目昆虫占70%以上，主要为蚜虫、叶蝉、飞虱类。还有甲虫、粉虱、蓟马等。3、土壤中的介体（1）真菌 已发现土壤中有7种真菌传播19种病毒，油壶菌属、粘菌属系植物的非致病菌，为主要的真菌介体；集壶菌、粉痂菌及腐霉菌除为植物本身病原菌外，还能传播多种病毒。病毒与真菌介体的关系除少数芸苔油壶菌为游动孢子体外带毒外，大多数为孢子内带毒，属持久性传毒。,（2）线虫 已知有5个属的线虫介体传播约23种病毒（如长针线虫、剑线虫、毛刺线虫等）。一般线虫蜕皮后就不能传毒，饲毒和传毒时间只要15分钟至1小时。线虫传播的植物病毒均属于非持久性，线虫传病毒也可借花粉、种子传，极易汁液传，许多线虫传病毒引致环斑型症状。4、螨类介体 主要是叶芽螨和蛛螨。螨和病毒的关系研究较多的是由曲叶螨（Aceria tulipae）传播的小麦条点花叶病毒，这是属于循回型，病毒主要存在于中肠，没有发现在体内增殖的现象。螨类只有在若虫期获毒以后才有传毒能力，带毒螨蜕皮后仍能传毒，但不能经卵传，汁液摩擦亦可传，螨类传播病毒的效率有时是很高的，如单个带条点花叶病毒的螨就能使小麦发病。,（二）植物病毒的非介体传播,1、汁液传播（sap transmission）汁液传播就是使病株的汁液通过机械造成的微伤进入健株体内使它发病，又称机械传播。需要整枝打杈、摘心、绑架的栽培作物上，是一些病毒的主要传播途径。烟草、番茄、辣椒上的烟草花叶病毒，瓜类、番茄上的黄瓜花叶病毒。在实验室通常采用机械的方法汁液磨擦进行人工接种，通过微伤口使病毒进入植物体内。2、种子传播（seed transmission）种子、块茎、球茎、鳞茎和花卉苗木等均可传播。种子传带病毒系由种子外部带毒、种胚外部带毒、胚乳带毒和种胚带毒。以豆科、葫芦科、菊科最普遍，是作物病毒病害的重要初侵染源。,3、嫁接传播（graft transmission）有些果树病毒病害以嫁接传播为其唯一已知的传播途径，例如苹果锈果病和花叶病等。这种传播方式在果树与某些经济林木（如桑树）以及观赏植物中非常重要，因此在繁殖工作中严格选用无病毒接穗和砧木已成为很重要的防治病毒病害的措施。4、菟丝子传播（dodder transmission）菟丝子传播病毒的性质和嫁接传毒相同，可以通过其桥梁作用，将一株寄主植物的病毒传递给另一株寄主。菟丝子的传播不受组织亲合性影响，可更广泛的应用价值。不能靠汁液摩擦接种、不能通过媒介昆虫传播的病毒、在亲缘关系差异太大的植物之间不能形成嫁接结合而传播病毒病时，大多可利用菟丝子传毒。,第四节 植物病毒的分类与命名,植物病毒的分类工作由国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Virus，ICTV）植物病毒分会负责。以往植物病毒的分类主要依据寄主植物种类、病害症状和传播方式等特性将其分为若干个组（group），分类的基本单元为“成员（member）”。1995年，ICTV发表了病毒分类与命名第六次报告，规定植物病毒与其它生物一样实行“目、科、属、种”的系统等级分类。新规定中的属相当于以前的组，而种则相当于以前的“成员”。ICTV第七次国际病毒分类报告规定病毒的种为基本分类单元。,一、植物病毒的分类,病毒的种是由自我复制谱系组成的多元等级，并占有特定生态空间。其中“自我复制的谱系”指的是病毒无性复制的群体及因基因组变异或再组合而形成的进化群体。“特定生态空间”是指病毒具有的寄主范围。病毒种以下可分为若干株系（strain）。而一些新获得的病毒，由于对其特征还不完全了解，不能确定其分类地位，常称作“分离物”（isolate）或“分离株”。截至1995年，为ICTV所承认的病毒数目为3600种，其中植物病毒种共有788个。ICTV将植物病毒划归为47个属，在其上建立了11个科、1个目。植物病毒可归为5个大类群：1、单链DNA（ssDNA）病毒类群 2、双链DNA（dsDNA）病毒类群 3、双链RNA（dsRNA）病毒类群4、负单链RNA（-ssRNA）病毒类群5、正单链RNA（+ssRNA）病毒类群,二、植物病毒的命名,采用得最多的是英文俗名法:寄主植物+症状（不采用斜体，常使用缩写）烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）有的按照发现的先后给予命名，如马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）等。俗名法的优点是简单、直观；其缺点是将病毒名与病害名二者合一，随着同种病毒在不同寄主上的发现，往往会造成一些理解上的困难，如黄瓜花叶病毒可侵染包括单子叶和双子叶在内的67个科470多种植物。,目前国际上采用类似于拉丁双名法来命名植物病毒:寄主名+症状+病毒属名 如Tobacco Mosaic Tobamovirus 属名采用斜体书写。植物病毒属名以-virus结尾，常由模式种寄主名称（英文或拉丁文）缩写+主要特征描述（英文或拉丁文）缩写+virus组合而成，书写采用斜体。如黄瓜花叶病毒属记作Cucumovirus。科、目的名称分别以-viridae和-virales为结尾，均采用斜体书写。,第五节 植物病毒检测与病毒病害,1、鉴别寄主 指用来鉴别某一病毒或其株系的具有特定反应的植物。凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并具有特征性症状的植物都可作为鉴别寄主。组合使用几种或一套鉴别寄主称为鉴别寄主谱。鉴别寄主谱中一般包括可系统侵染的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。鉴别寄主谱的方法简单易行，优点是反应灵敏，只需要很少的毒源材料。但工作量比较大，需要较大的温室种植寄主植物，且比较费时。有时因气候或栽培等原因，症状反应不十分稳定。,一、植物病毒的检测,（一）生物学检测,2、植物病毒粒体的稳定性 对汁液传播的病毒，可通过病株汁液的体外性状（钝化温度、稀释限点和体外存活期）来测定；这些性状虽易受各种因素影响，但仍可作为区别不同病毒的依据之一，而且对混合侵染病毒的分离及制定病毒提纯方案具有参考价值。钝化温度（Thermal Inactivation Point，TIP）病毒在病株粗汁液中，经恒温水浴处理10分钟即丧失侵染力的最低温度。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有45；最高的是烟草花叶病毒，为97；而大多数植物病毒为5570。一种病毒的不同株系可以有不同的钝化温度，所以是鉴定病毒的一项有用的指标。,稀释限点（Dilution End Point，DEP）病毒在病株粗汁液中，经若干倍数的稀释后仍能保持其侵染力的最大稀释倍数.用10-1，10-2，10-3表示。一般的植物病毒DEP为10-210-。稀释限点与汁液中病毒粒子的浓度有关，浓度愈高，稀释限点也愈大。而病毒的浓度往往受栽培条件、寄主植物状况所影响。因此报道中同一病毒的稀释限点不一定是相同的，只能作为鉴定病毒的参考指标。体外存活期（Longevity in vitro，LIV）病毒在病株粗汁液中，置于2022室温下，能够保持侵染力的最长时间。大多数病毒的LIV在数天到数月。由于在不同植物汁液中存在不同的酶或抑制物，从而使病毒的体外存活期也可能有较大的差异，所以这项指标也只能在鉴定病毒时参考。,病毒粒体十分微小，只有在电子显微镜下才能观察到。电镜观察时，病毒样品须经过负染处理，使病毒粒体表面附着一层重金属离子，置于特殊的载网和支持膜上，放入电镜真空样品室中进行观察。（三）血清学检测 抗原（antigens）：一切能在动物体内诱导产生抗体的物质，都叫抗原。蛋白、蛋白降解物、多糖等。抗体（antibody）:是动物抵抗外来的抗原而产生的一种物质。抗原抗体的结合过程叫血清学反应。抗血清（antiserum）:含有抗体的血清。利用植物病毒外壳蛋白的抗原特性，制备特异性的抗血清。利用抗原抗体特异性结合可以鉴定病毒。,（二）电镜观察,抗血清的制备：纯化病毒；注射小动物（兔子、小白鼠等）；取血获得抗血清。检测方法：琼脂双扩散法酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）（四）分子生物学检测1、聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是二十世纪八十年代发展起来的一种DNA特定片段体外扩增技术，已被广泛地应用于植物病毒检测。其优点是快速、灵敏、特异性强。,（1）将反应体系（模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶）置高温下变性（使模板双链DNA解链为两条单链）；（2）在低温下退火（使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA）；（3）在中温下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5端向3端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。反复进行这种循环，可使两端引物限定范围内的模板DNA序列以指数形式扩增。一个目的DNA分子经20轮扩增后，可达106。当DNA片段扩增到一定数量时，经电泳分离，再经溴乙锭处理，在紫外光下可以肉眼观察到并确定扩增片段的大小，从而判定检测样品中是否含有目的DNA片段。,PCR的基本过程如下：,（a）PCR反应组份,（b）PCR反应三步曲,大多数植物病毒基因组为RNA，而Taq DNA聚合酶不能以RNA为模板合成DNA链，这就需要首先在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成互补的第一链DNA，之后才能进行常规PCR反应，这一技术称为反转录PCR（Reverse transcription PCR，简称RT-PCR）。,RT-PCR检测番木瓜环斑病毒电泳结果,1、有一些植物在一定的条件下隐症带毒，即植物受到病毒的侵染但不表现明显的症状。2、还有一些病毒引起观赏植物颜色和形态的变异，反而增加了植物的观赏价值，荷兰的郁金香杂色变种等。3、植物病毒病害观察不到病征。4、症状表现受温度的影响较大，常发生高温或低温隐症现象。,二、植物病毒病害,（一）特点,2、核酸杂交 原理：DNARNA碱基互补关系。杂交：DNARNA形成异质双链的过程。利用根据已知序列合成或制备的核苷酸片断探针（probe）是否能与待测核酸杂交，判断与已知片断是否有同源性。,5、绝大多数的植物病毒侵入寄主植物后可以引起植物叶片不同程度的斑驳、花叶或黄化，同时伴随有不同程度的植株矮化、丛枝等病害症状，以及产量的降低。有一些病毒引起卷叶、植株畸形。少数病毒还能在叶片或茎秆上造成局部坏死或瘤肿、脉肿等增生症状。,菜豆花叶病症状,芜菁黄化花叶病毒病症状（黄化）,CMV症状（西葫芦明脉）,豌豆耳突花叶病毒病症状（耳突）,小麦土传花叶病毒病（条纹）,番木瓜环斑病毒病症状（畸型）,混合侵染（或复合侵染）：植物受多种病毒或一种病毒的不同株系同时侵染的现象。混合侵染的病毒在植株体内会发生相互作用，这种相互作用可分为下列几种类型：（1）协生作用：混合侵染后，引起的病害症状比两种病毒单独侵染更为严重。如番茄花叶病毒和马铃薯X病毒，两者分别侵染番茄都只表现轻微斑驳症状，但当两者同时侵染时，则引起番茄茎、叶和果实坏死，甚至全株死亡。（2）撷颃作用：一种病毒对另一种病毒产生抑制作用。如在烟草植株体内，烟草蚀纹病毒抑制天仙子花叶病毒和马铃薯Y病毒的增殖。（3）交互保护作用：先侵染的病毒保护植物不再受另一种病毒的侵染。这种作用可发生在两种病毒或一种病毒两个不同株系之间，其作用通常是相互的。习惯上“交互保护”特指用致病力弱的病毒或株系（生产上称为弱毒疫苗）保护植物免受强致病力的病毒或株系的侵染。,（二）重要的植物病毒属、种,1、烟草花叶病毒（TMV）,为烟草花叶病毒属的典型种,（1）病毒粒体特性：杆状粒体（18300nm），（+）ssRNA,（2）寄主范围与症状：寄主范围广（如烟草、番茄、辣椒、豆类等），多引起花叶症状,（3）极易机械性传毒,（4）病毒的稳定性强,2、黄瓜花叶病毒（CMV）,为黄瓜花叶病毒属的典型种,（1）病毒粒体球状（正二十面体，28nm），（+）ssRNA,（2）寄主范围广（50多个科、100多种植物）,（3）传毒：经机械传毒、多种蚜虫非持久性传、种子传毒,3、马铃薯Y病毒属 Potyvirus,（1）植物病毒中最大的一个属，含有75个种和93个可能种，有许多引起重要农作物病害。,马铃薯Y病毒（PVY），引起许多茄科植物病毒病,大豆花叶病毒（SMV），引起豆科植物花叶病,西瓜花叶病毒2号（WMV-2）：引起瓜类花叶病,番木瓜环斑病毒（PRSV）：引起番木瓜花叶病,（2）病毒粒体呈线状（75012 nm），(+)ssRNA,（3）传播：多种蚜虫非持久性传播，部分病毒可以由种子传播,（三）植物病毒病的防治,1、检验检疫,防止危险性病毒从境外传入,2、无病种苗,无病留种高温处理茎尖脱毒培养（结合检验检测）,3、作物合理布局,减缓病害流行速度、减少重大损失,4、培育和采用抗病品种,常规育种、基因工程育种,5、清除早期病株、防除传毒介体,银灰色避蚜,6、农业措施,调节播期、田园清洁（除杂草）、加强肥水管理,7、其他,弱株系保护作用、药剂防治,第六节 亚病毒,亚病毒（Subvirus）是指一类不具有完整病毒结构或功能的分子生物，1981年由法国Lwoff提出。一、类病毒（viroid）类病毒是指无外壳蛋白包被的小分子环状单链RNA，单独具侵染性，能自我复制，致病或不致病。致病症状：畸形、坏死、变色。致病特点：隐症感染、潜育期长、稳定性高、传染力强。1971年Diener首次在描述马铃薯纺锤块茎病的病原时使用类病毒（viroid）一词。之后陆续在一些植物中发现这类小分子核酸寄生物。如柑桔裂皮病、椰子死亡病、苹果锈果病等。,菊花矮化类病毒 Chrysanthemum stunt viroid Affected flowers in the foreground are also showing premature opening and colour break.,菊花矮化类病毒 Chrysanthemum stunt viroid Affected flower（right）The flower is reduced in size and showing marked colour bleaching.,在植物病毒中，有些病毒粒体内除自身的基因组RNA外，还包含一种小分子RNA，它与病毒基因组核苷酸序列没有同源性，无编码能力，必须依赖其相关病毒（称为辅助病毒）才能侵染和复制。其中分子结构为环状的称为拟病毒（virusoid），分子结构为线状的称为卫星RNA（satellite RNA，sRNA）。目前已在许多病毒中发现有卫星RNA的存在，如CMV卫星RNA等。三、卫星病毒 卫星病毒是指在病毒基因组之外，依赖于该病毒（称为辅助病毒）活动的由核酸分子组成的亚病毒因子，并用自己的核酸编码外壳蛋白进行包装。它与辅助病毒一起侵入寄主植物，对侵染有加强作用。卫星病毒核酸的核苷酸序列与辅助病毒的基因组序列无同源性。因此卫星病毒与辅助病毒没有血清学关系。如：烟草坏死卫星病毒（Satellite tobacco necrosis virus，STNV）、玉米白线条花叶卫星病毒（Maize white-line mosaic satellite virus）等。,二、拟病毒与卫星RNA,病毒与亚病毒的性状比较,本章复习思考题,1、植物病毒的本质是什么?2、植物病毒是如何传播的?3、怎样利用交互保护反应防治病毒病?4、实验室鉴定植物病毒依据哪些原理和方法?5、类病毒与病毒有哪些异同点?,复习思考题参考答案,1、植物病毒的本质是什么?答：病毒（virus）是包被在蛋白或脂蛋白保护性衣壳中，只能在适合的寄主细胞内完成自身复制的一个或多个基因组的核酸分子，又称分子寄生物。病毒的复制依赖于寄主的蛋白质合成系统，需要寄主提供原材料，靠脂蛋白双层膜定位在寄主细胞内的位点上。病毒区别于其它生物的主要特征是：病毒是个体微小的分子寄生物，其结构简单，主要由核酸及保护性衣壳组成；病毒是严格寄生性的一种专性寄生物，其核酸复制和蛋白质合成需要寄主提供历材料和场所。按它们寄主性的不同,病毒分为寄生植物的植物病毒（Plant virus）寄生动物的动物病毒以及寄生细菌的噬菌体等。,2、植物病毒是如何传播的?答：病毒是专性寄生物，在自然界生存发展必须在寄主间转移，植物病毒从一植株移或扩散到其它植物的过程称为传播（transmission），而从植物的一个局部到另一局部的过程称为移动（movement）。因此，传播是病毒住植物群体中的转移，而移动是病毒在个体中的位移。根据自然传播方式的不同，可以分为介体传播和非介体传播两类。介体传播（vector transmission）是指病毒依附在其它生物体上，借它生物体的活动而进行的传播及侵染。包括动物介体和植物介体两类。在病毒传递中没有其它它机体介入的传播方式称非介体传播，包括汁液接触传播、嫁接传播和花粉传播。病毒随种子和无性繁殖材料传带而扩大分布的情况则是一种非介体传播。病毒不同于真菌，在寄主体外的存活期一般比较短，也没有主动侵入寄主无伤组织的能力，因此只有被动的传播，不像真菌那样主动和有效。植物病毒的有效传播，近距离主要靠活体接触摩擦而传播，远距离则依靠寄主繁殖材料和传毒介体的传带。,3、怎样利用交互保护反应防治病毒病?答：在植物病毒学的研究中，人们早已发现病毒近缘株系间有“交互保护作用”。当植物寄主接种弱毒株系后，再第二次接种同一种病毒的强毒株系，则寄主抵抗强毒株系，症状减轻，病毒复制受到抑制。利用植物诱发抗病性来控制病害是一个很有希望的研究方向。人们试图利用病毒的弱毒株系或病原菌弱毒菌系来诱发植物抗病性来防治病害。这类研究多是在人工控制条件下进行的，还缺乏有关诱发抗病性的稳定性和持久性，防病增产效果以及应用技术的田间研究。另外，也没有证据表明诱发抗病性能够遗传传递，因而短时间内还难以在生产中应用诱发抗病性。,4、实验室鉴定植物病毒依据哪些原理和方法?答：植物病毒鉴定的主要目的是确定一种病毒在分类系统中的地位，由于植物病毒个体微小，结构简单，对寄主的依赖性强，鉴定工作难度大，技术性强，对工作条件的要求高。鉴定植物病毒过去大多采用病毒间生物学特性的差异，如所致症状类型、传播方式、寄主范围等；现在则增加了病毒核酸、蛋白分子生物学、生物化学等方面的方法。常用的方法有生物学实验、血清学检测和电子显微镜观察等。,5、类病毒与病毒有哪些异同点?答：类病毒是存在于植物中分子量为1105左右的、具有很高碱基配对的单链环状植物致病RNA，在健康寄主中不能检查到，它能在寄生体内自主复制，并引起特殊的症状。类病毒病害过去相当一段时间是作为病毒病来研究的，但由于始终不能看到病毒粒体，而不能确定病毒的归属。后来提纯得到核酸，证明了核酸的侵染性。最后确定为一类新的病原。类病毒（viroid）引起的病害症状主要有畸形、坏死、变色等类型。典型病害是引起马铃薯纺锤块病（PSTVd）。类病毒对热以及对紫外光和离子辐射有高度的抗性，因为它的分子内含有互补的密集区域和以共价键结合成环状结构。目前已经发现了30多种类病毒，其中23种的核苷酸序列已经被分析出来。,