《核酸组织化学》PPT课件.ppt

核酸组织化学,组胚教研室 姜玉峰,核酸：1.核糖核酸（RNA）：核仁和核糖体 2.脱氧核糖核酸（DNA）：核内的染色质或染色体,Feulgen反应1924年提出,特异性显示DNA分子形态学方法DNA在酸性环境下水解,断开糖苷键,形成醛基醛基再与shiff液中的碱性品红特异性结合,形成紫红色醌基,Feulgen反应应用：肿瘤细胞具有高增生的DNA含量,鉴别并协助诊断肿瘤的良恶性细胞及原代培养细胞DNA分子的检测与鉴定,Feulgen反应Schiff液的配制0.05g碱性品红研细，溶于含0.5mL浓HCl的50mL水中，再加入0.5g Na2SO3固体，搅拌后，静置，直到红色褪去,Feulgen反应步骤 1.石蜡切片 2.切片脱蜡入水 3.切片用1mol/L HCL冲洗 4.1mol/L HCL60 温箱水解8 min 5.室温1mol/L HCL冲洗,Feulgen反应步骤6.蒸馏水洗 7.暗处入Schiff液染色60 min8.亚硫酸钠溶液洗3次约6 min9.蒸馏水洗 10.脱水透明、封固。,Feulgen反应注意事项1.不能用含甲醛固定液，可用Carnoy固定液2.尽量不用冰冻切片，减少非特异染色3.控制盐酸水解温度和时间,吖啶橙染色三环芳香类阳离子型碱性荧光染料嵌入核酸双链的碱基对与单链核酸的磷酸发生静电相互作用,吖啶橙染色与DNA结合,525nm,绿色荧光与RNA结合,650nm,橙红色荧光与单链核酸的磷酸发生静电相互作用,吖啶橙染色应用：区分活细胞和死细胞,活细胞核呈黄绿色荧光,死细胞呈红色荧光(溶酶体酶释放所致)原位区分组织细胞DNA和RNA,吖啶橙染色应用：恶性肿瘤普查:非典型增生:荧光增强增生细胞:强荧光恶性肿瘤细胞:橘红色或火焰,吖啶橙染色步骤1.95%酒精固定 2.滴加0.01%浓度的吖啶橙荧光染液染色5min3.PBS漂洗lmin4.用0.1molL氯化钙溶液分色lmin 5.PBS冲洗、封片,荧光显微镜下观察,吖啶橙染色注意事项吖啶橙浓度过高(1:500)或过低(1:105),影响准确性和可信性甲醛固定的石蜡切片效果不理想3.PH6.0,DNA结合染料的聚合加速,PH低于3.8,DNA结合染料的聚合抑制,DAPI染色4，6二脒基-2苯吲哚与DNA特异性结合的荧光染料可以穿透活细胞胞膜，无明显细胞毒性与双链DNA结合,荧光强度增强20倍,与单链DNA结合,无荧光增强,DAPI染色步骤1.培养细胞或组织冰冻切片,PBS漂洗5min2.DAPI工作液室温染色5-20 min3.PBS漂洗4.水溶性封片剂封片,荧光显微镜下观察,*较多单转150Q细胞胞核凋亡，多数共转150Q和GRP78细胞胞核正常,150Q GRP78 DAPI,改变GRP78水平对突变Htt细胞毒性的影响,DAPI染色,DAPI染色优点1.荧光稳定性优于Hoechst2.特异性较EB,PI高,Hoechst33258染色非嵌入性的荧光染料与DNA小沟富集AT的区域结合活细胞或固定细胞亮蓝色荧光,Hoechst33258染色步骤1.培养细胞或细胞悬液,PBS漂洗5min2.Hoechst33258工作液室温染色15min3.PBS漂洗4.水溶性封片剂封片,荧光显微镜下观察,碘化丙啶（PI）染色不能透过完整的细胞膜正常细胞和凋亡细胞PI拒染坏死细胞核染红色,PI染色应用：区分凋亡和坏死细胞AnnexinV-FITCPI双染流式细胞术：细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞外侧，AnnexinV和PS具极强的结合力，坏死细胞和凋亡细胞绿色坏死细胞核被PI染成红色,双变量FCM的散点图左下象限显示正常活细胞，为FITC-，PI-；右上象限为坏死细胞，为FITC+，PI+；右下象限为凋亡细胞，呈现FITC+PI-,